广西苦瓜白粉病菌生理小种鉴定与抗白粉病SNP分子标记的开发

摘要

苦瓜白粉病是危害苦瓜生产的重要病害，其防治的最有效措施就是抗病品种的选育和利用，但苦瓜白粉病生理小种鉴定和分子标记辅助育种等基础研究还存在着许多不足。本试验对供试苦瓜白粉病病菌分别采用国际通用的13个甜瓜鉴别寄主和6个苦瓜专用型鉴别寄主，两套体系进行鉴定，并对白粉病菌接种及菌株保存方法进行了研究。单核苷酸多态性(SNP)被认为是最有发展潜力的第三代分子标记，本研究利用SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)技术，以高抗白粉病自交系MC18和高感白粉病自交系MC105及其通过抗感鉴定的杂交F2代叶片DNA为材料，对苦瓜遗传分离群体（2个亲本和30+30的混池）进行关联分析，筛选到29个与目标性状相关联的候选位点。而后利用测序得到的序列，采用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS PCR)特异性扩增的方法和酶切扩增多态性序列(CAPS)酶切的方法，开发实用的SNP标记，并对其反应条件进行优化与验证。主要实验结果如下:　　1.通过两套鉴别体系进行比对鉴定，初步确定广西地区苦瓜白粉病的优势生理小种为S.fuligginea的生理小种1和生理小种M-4。分别用白粉孢子接种法、贴病叶法和悬浮孢子喷液法将该白粉病病原接种于寄主叶片上，观察不同接种方法对白粉病发病的影响，结果显示:白粉孢子接种法发病早且重;贴病叶法其次，病斑集中产生于贴叶处;悬液法虽发病稍晚，但发病均匀且易于鉴定。　　2.利用SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)技术对苦瓜遗传分离群体（2个亲本和30+30的混池）进行关联分析，共获得多态性SLAF标签5502个，多态性标签的比例为5.99％。对多态性SLAF标签进行关联性分析，筛选到29个与目标性状相关联的Marker。　　3.利用筛选得到的29个与目标性状相关联的Marker，用在线引物设计软件http://primerl.so ton.ac.uk/primerl.html进行引物设计，共设计了46组引物。经过对扩增条件和扩增体系的优化，得出最优Tetra-primerAMRS PCR的反应条件为。利用优化好的体系来对Tetra-primer AMRS PCR引物组进行筛选，筛选获得3组在父母本及F2代检测到多态性的Tetra-primer AMRS PCR分子标记引物，分型结果稳定，重复性好。　　4.利用测序得到的序列，使用在线酶切位点识别软件http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html在含有关联Marker的候选SNP序列中筛选存在CAPS突变的位点，挑选出合适的内切酶，然后利用引物设计软件Primer5.0设计CAPS引物。利用优化好的体系最后筛选出Marker8515具有酶切扩增多态性，且分型结果稳定，可作为CAPS标记。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 概述

1．2 瓜类蔬菜白粉病病原菌研究

1．2．1 瓜类蔬菜白粉病病原的种类、分布与鉴定

1．2．2 瓜类蔬菜白粉病生理小种的种类、分布与鉴定

1．2．3 瓜类蔬菜白粉病的发生与防治

1．3 瓜类蔬菜抗白粉病分子标记研究进展

1．3．1 DNA分子标记技术

1．3．2 SNP标记的研究进展

1．3．3 分子标记在瓜类蔬菜抗白粉病育种研究中的应用

1．4 本研究的目标和意义

1．5 本研究采取的技术路线

第二章 广西苦瓜白粉病生理小种的鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验设计

2．1．3 菌株保存和纯化方法

2．1．4 接种方法预实验

2．1．5 苦瓜白粉病病原种和生理小种的鉴别

2．2 结果与讨论

2．2．2 接种方法

2．2．3 广西部分地区苦瓜白粉病菌病原鉴定结果

2．2．4 广西部分地区苦瓜白粉病菌生理小种的鉴定结果

2．3 小结与讨论

第三章 基于简化基因组测序技术的苦瓜Super BSA抗病基因定位个性化分析

3．1 研究概况

3．1．1 研究依据

3．1．2 群体基本信息

3．1．3 分析结果概述

3．2 试验流程

3．2．1 酶切试验流程

3．2．2 酶切结果测序分析流程

3．2．3 SLAF标签的开发流程

3．3 分析方法和结果

3．3．1 测序数据统计与评估

3．3．2 实验建库评估

3．3．3 关联分析

3．4 小结与讨论

第四章 四引物扩增受阻突变体系PCR在苦瓜抗白粉病分子标记开发中的应用

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 DNA检j则

4．2．2 四引物ARMS PCR引物设计

4．2．3 四引物ARMS PCR体系的优化

4．2．4 四引物ARMS PCR优化体系验证

4．3 小结与讨论

第五章 CAPS分子标记在苦瓜抗白粉病分子标记中的开发与利用

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验方法

5．2 CAPS标记的获得

5．3 小结与讨论

第六章 全文结论与问题展望

6．2 存在问题

6．3 研究展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间论文发表情况