慢病毒介导FGFR1沉默的人乳腺癌稳定细胞株的建立及差异表达基因的筛选

摘要

目的:通过慢病毒介导建立成纤维生长因子受体1(fibroblast growthfactor receptor1，FGFR1)沉默的高转移性乳腺癌细胞模型，进行全基因组表达谱基因芯片分析，筛选出FGFR1沉默组与对照组中差异表达的基因，为探索FGFR1参与调控乳腺癌细胞生物学活性的分子机制提供实验依据。　　方法:(1)慢病毒相关质粒的扩增。首先将6个慢病毒相关质粒（慢病毒包装质粒psPAX2、包膜表达质粒pMD2.G、表达载体对照质粒shRNA control lentivirus/pGIPZ和shRNA non-silencing control/pGIPZ和表达载体shRNA干扰质粒hu-FGFR1(1)shRNA/pGIPZ、hu-FGFR1(2)shRNA/pGIPZ)分别转化到大肠杆菌，小量提取上述六种质粒，分别用相应的限制性核酸内切酶进行酶切鉴定，再大量提取这些质粒并定量。(2)慢病毒表达载体质粒干扰效率的初步鉴定。以高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231/LM3.3为实验对象，用Lipofectamine2000进行细胞转染。实验分为五组:空白组（B组:未作处理的野生型细胞）;对照组(L1组:转染shRNA control lentivirus组;L2组:转染shRNA non-silencing control/pGIPZ;)和实验组(F1组:转染hu-FGFR1(1)siRNA/pGIPZ; F2组:转染hu-FGFR1(2) shRNA/pGIPZ)。(3)慢病毒颗粒的制备。培养HEK293T细胞(Human Embryonic Kidney293T cells，HEK293T)，分别包装四种慢病毒颗粒。将慢病毒包装质粒psPAX2和包膜表达质粒pMD2.G分别与4种表达载体质粒（对照表达载体质粒shRNA control lentivirus/pGIPZ、shRNA non-silencing control/pGIPZ和shRNA干扰表达载体质粒hu-FGFR1(1)shRNA/pGIPZ、hu-FGFR1(2)shRNA/pGIPZ)组合成4套三质粒慢病毒表达系统，采用Lipofectamine2000分别将其共转染至慢病毒包装细胞HEK293T，分别命名为HEK293T-control(C1)、HEK293T-non-silencing(C2)、HEK293T-FGFR1(1) siRNA(D1)/HEK293T-FGFR1(2)shRNA(D2)o(4) FGFR1沉默的稳定细胞株的筛选。培养MDA-MB-231-LM3/LM3.3细胞，用不同浓度的嘌呤霉素处理细胞，每三天换液一次，细胞全部死亡的嘌呤霉素的最小浓度，即确定为嘌呤霉素的最佳筛选浓度;分别用4种慢病毒感染MDA-MB-231-LM3/LM3.3细胞48小时后，用最佳浓度的嘌呤霉素处理上述四种细胞，每三天换液一次，直至没有慢病毒感染的空白组细胞(B)全部死亡。扩增培养对照组(C1、C2)及实验组(D1、D2)的存活细胞，冻存。(5)稳定细胞株的鉴定。培养上述4种筛选获得的稳定细胞，提取总蛋白并定量;Western Blot检测各细胞中FGFR1蛋白的表达情况。(6)差异表达基因的基因芯片分析。培养上述2种筛选获得的稳定细胞(C2、D2)，用FGFR1的配体FGF2处理6小时，收集细胞，充分溶于RNA提取试剂TRIzol中，低温保存，送上海伯豪生物技术有限公司进行全基因组表达谱芯片检测。　　结果:(1)成功提取并鉴定了六种慢病毒相关质粒。(2)确定了嘌呤霉素的最佳筛选浓度为0.7μg/ml。(3)成功建立了四种稳定转染的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231/LM3.3，包括靶向FGFR1沉默的细胞株(D1、D2)和对照细胞株(C1、C2)。(4)筛选出与FGFR1沉默相关的差异表达基因37个。生物信息学分析表明:这些差异表达的基因主要分布在“KEGG调控通路”中:癌症通路(pathways in cancer);细胞因子、生长因子和趋化因子途径(growthfactor，cytokine，chemokine pathways);JAK-STAT信号途径(JAK-STATsignaling pathway);集落粘附通路(focal adhesion pathway)，这些调控通路都与乳腺癌细胞的生长和转移有关。　　结论:(1)成功建立FGFR1沉默的高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231/LM3.3-D1和MDA-MB-231/LM3.3-D2，为研究FGFR1在乳腺癌细胞的生长与转移等过程中的作用及分子机制的探讨提供了良好的细胞模型。(2)全基因组表达谱芯片分析获得FGFR1基因沉默相关的差异表达基因37个，为进一步探索FGFR1参与调控乳腺癌细胞生长、转移等的分子机制提供了重要的实验依据，并为下一步寻找抑制乳腺癌生长转移的分子靶点奠定基础。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 试剂及配制

3 实验耗材和实验仪器

4 分析软件

5 实验方法

结果

1、质粒的鉴定

2、质粒的大量提取

3、shRNA慢病毒表达质粒瞬时转染人高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231／LM3．3

4、慢病毒感染人高转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231／LM3．3及FGFR1沉默的稳定细胞株的筛选

5、FGFR1沉默的稳定细胞株中的Western Blot鉴定

6、FGFR1沉默稳定细胞株的全基因组表达谱的基因芯片检测

讨论

1、慢病毒三质粒系统及稳定细胞株的建立

2、稳定细胞株差异表达基因结果的分析

结论

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

综述 FGFR1在肿瘤转移及治疗中的研究进展

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