内生真菌Trichoderma atroviride D16促进丹参酮合成的机制及其栽培应用

摘要

丹参Salvia miltiorrhiza Bge.是唇形科鼠尾草属植物，其干燥根及根茎入药，在中国已有近2000年的应用历史，是中国临床目前应用最广泛、最重要的中药品种之一[1]。由于丹参野生资源被过度开发，栽培品种活性成分含量低、稳定性差、生长周期过长，导致在市场上栽培丹参供不应求。内生真菌是在一段时间或者整个生活阶段里，宿主于健康植物的组织和器官内部，但是不会造成宿主植物的损害或者过敏反应的真菌。根据已有研究，这类内生真菌对药用植物生长及其次生代谢物质积累具有显著性促进作用，可能对中药品质产生重要影响。所以，前期本课题组从内生真菌入手，期望能通过对丹参内生真菌的分离研究达到改善栽培丹参现状的目的。前期课题组从道地产区陕西商洛的栽培丹参中分离出一株优势内生真菌深绿木霉Trichoderma atrovirideD16，该内生真菌不仅可以显著性促进丹参毛状根生长，而且能大幅度地提高丹参毛状根中丹参酮类活性物质的积累，其促进效果远远高于其他已有的化学或生物诱导子，并且确定了T.atroviride D16的活性部位是多糖部位（Polysaccharide fraction，PSF），通过代谢组、蛋白质组及转录组技术，对其作用机制进行了初步探讨。然而，目前关于内生真菌影响中药材品质的机制研究尚不够深入，对内生真菌生物菌肥在药用植物栽培上的应用存在一定的制约。　　基于T.atrovirideD16的活性因子及比较转录组学的已有研究基础上，本课题进一步对内生真菌D16促进丹参生长和丹参酮合成的机制进行深入研究，为揭示内生真菌与药用植物之间的作用机制提供实验依据，并为内生真菌开发成为生物菌肥的实际应用提供理论依据。本课题通过对T.atrovirideD16的活性因子PSF进一步的分离纯化，明确其活性成分;通过考察H2O2，Ca2+，NO，SA，JA，ABA等信号分子在D16活性因子促进丹参酮类成分生物合成过程中所起的作用，构建信号转导网络，明确D16活性因子促进丹参酮类成分生物合成的信号转导网络;通过比较代谢组学的深入研究分析和对已有文献研究整合，对关键转录因子进行进一步的筛选和确定，进一步阐明D16活性因子促进丹参酮类成分生物合成的分子机制;通过在人工气调室的栽培试验进一步确定T.atroviride D16作为生物菌肥的最佳施用方式和施用剂量，而后通过大田试验，考察T.atroviride D16作为生物菌肥在实际栽培上的作用，进一步确定T.atroviride作为生物菌肥开发上的有效性和经济性。主要研究结果如下:　　1.首次明确了内生真菌T.atrovirideD16的活性单糖的化学结构。通过现代化学分离手段，初步探明多糖部位PSF是D16促丹参酮合成的活性因子。在此基础上，通过活性因子PSF的单糖组分分析结果发现，PSF作为一个有机整体能显著促进丹参酮的合成;通过对D16的活性部位PSF进一步分离及生物效应分析，确定了T.atrovirideD16PSF的水提取部位是主要的活性部位;最后，通过对T.atrovirideD16PSF的水部位进行分离纯化得到含量最大的均一多糖样品——PSF-W-1，并解析了PSF-W-1的化学结构式，分析了其理化性质。这是内生真菌Trichoderma atrovirideD16活性多糖的首次分离鉴定，为研究内生真菌与植物表面受体的作用提供了优质的科研材料。　　2.通过比较转录组学的分析，初步确定过氧化物、Ca2+，JA，SA，ABA和NO等信号转导过程基因的差异表达促进转丹参酮类活性成分含量发生变化。而后，通过对各个信号分子的含量变化以及抑制剂作用效果分析，进一步确定各个信号分子在促进丹参酮类活性成分积累过程中的作用。结果表明，H2O2是介导T.atroviride D16PSF促进丹参毛状根中丹参酮类活性成分积累的关键信号分子。而NO和ABA很可能是介导T.atroviride D16PSF促进丹参毛状根中丹参酮类活性成分积累的下游信号分子。在此基础上，提出了PSF很有可能通过H2O2信号分子，传递给NO、ABA，进而诱导丹参酮类活性物质的积累的假说。此外，这是首次发现ABA可能介导了次生代谢物质的积累。而且，H2O2可以显著性促进丹参毛状根中丹酚酸B的合成，这为毛状根生产体系优化提供了新思路。　　3.通过进一步分析比较转录组学以及整合丹参转录因子的研究，初步明确D16PSF促进丹参酮合成的关键转录因子SmERF1B、SmGRF1和SmMYB86。通过对关键转录因子SmERF1B，SmGRF1和SmMYB86进行全长克隆以及生物信息学分析，确定了三个转录因子SmERF1B，SmGRF1和SmMYB86分别编码164、375和318个氨基酸;通过NCBI中BLAST分析显示，SmERF1B含有AP2结构域，SmGRF1含有QLQ和WRC结构域，SmMYB86含有SANT结构域。通过亚细胞定位分析，确定了三个关键转录因子表达部位都在细胞核中。通过查阅文献，发现这三个转录因子是特异性响应Trichoderma atroviride D16活性因子，构建三个转录因子的过表达体系，为丹参酮工业化生产提供了高效的原材料。　　4.通过在人工气调室的栽培试验，将Trichoderma atroviride D16制作成传统的固体生物菌肥，与将Trichoderma atroviride D16的活性因子PSF制作成菌剂的作用效果相比较，初步明确了D16作为固体生物菌肥的作用效果较佳，并且确定了Trichoderma atroviride D16最佳施用量为15g D16生物菌肥/棵。通过大田试验，进一步确定Trichoderma atroviride D16固体生物菌肥的作用效果。Trichoderma atroviride D16固体菌肥对丹参生长和次生代谢的促进作用远远高于已研究的丹参菌肥，可以显著改善丹参品质，为开发高效、经济、环保的丹参生物菌肥提供了优质原材料。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章内生真菌Trichoderma atroviride D16活性因子PSF的分离和鉴定

第一节PSF单糖组成及生物学活性分析

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二节PSF活性部位的分离及生物学活性分析

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三节PSF活性单糖的分离鉴定

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二章Trichoderma atroviride D16PSF诱导丹参毛状根丹参酮合成的信号分子作用

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二节Ca2+在D16PSF诱导丹参酮合成过程中的作用

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三节D16PSF诱导丹参酮合成过程中植物激素含量变化

一、材料、试剂与仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三章D16PSF诱导丹参酮合成的关键转录因子的筛选

第一节PSF处理下的比较转录组学深度分析

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二节SmERF1、SmGRF1和SmMYB86的全长克隆

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

第三节SmERF1B、SmGRF1和SmMYB86的亚细胞定位

一、材料、试剂与仪器

二、实验方法

三、实验结果

第四节过表达毛状根体系的构建

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第五节SmERF1-Crispr／cas9发根体系的建立

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第四章Trichoderma atroviride D16的栽培应用

第一节Trichoderma atroviride D16不同施肥对丹参生长和品质的影响

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二节不同剂量的Trichoderma atroviride D16菌肥对丹参苗生长和品质的影响

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三节Trichoderma atroviride D16菌肥的大田试验研究

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第五章研究总结与展望

参考文献

附录

文献综述 The regulatory mechanism of fungal elicitor-induced secondary metabolite biosynthesis in medical plants

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢