新疆维吾尔族IgA肾病与糖基化关键酶编码基因相关性研究

摘要

目的：　　1.以C1GALT1、C1GALTlCl、ST6GALNAC2作为候选基因，在新疆地区IgA肾病患者中筛查其单核苷酸多态的分布及频率。　　2.选择具有代表性的SNPs位点，探讨 C1GALT1 、C1GALTlCl 、ST6GALNAC2糖基化关键酶基因单核苷酸多态性与新疆地区IgA肾病临床病理的相关关系，从而为新疆地区IgA肾病早期发现干预、风险评估等提供新靶点。　　方法：　　选取维吾尔族及同期汉族IgA肾病患者，分别为90 例和120 例，选取同期健康体检者100例作对照，提取静脉血DNA进行PCR，对 PCR 产物直接测序，筛查C1GALT1、C1GALTlCl、ST6GALNAC2基因的5’区、5’UTR、编码区、外显子相邻部分内含子、3’UTR、3’区，筛查C1GALT1、C1GALTlCl、ST6GALNAC2的SNPs的分布，基因型和等位基因频率；　　等位基因及基因型频率采用直接计数法，基因型群体遗传学 Hardy-Weinberg 平衡估计采用 HWE 软件。通过 SPSS17.0 完成其他数据统计分析，两组间计量资料比较采用 t 检验，构成比采用 2×2 列联表 χ2 检验，P＜0.05 差异有统计学意义。　　结果：　　1、候选基因单核苷酸多态的分布及频率筛查　　下载候选基因DNA和mRNA序列，进行序列比对， 对DNA序列进行编辑和注释。针对候选基因编码区和调控序列，采用generunner8.0合成9对引物，以新疆地区IgA患者90个DNA 作对照，对编码、调控区进行扩增及测序，应用软件读取测序峰图及序列图多态性。PCR扩增成功率达100%，次测序成功率则为65%，再经补测序后可达100%，测序总长度为9253bp。　　共发掘6个SNP，5个等位频率＞10%。在基因内不同区段，SNP分布密度有所差异。筛查基因组区段中，平均分布密度925.3bp/SNP。　　2.1 入选研究对象的-般状况　　维吾尔IgAN组男41例，女49例，平均年龄38.81±11.06岁，汉IgAN组男66例，女54例，平均年龄39.14±10.22岁，对照组男50例，女50例，均为维吾尔族，平均年龄37.53±11.68，三组性别和年龄相匹配，差异无统计学意义（P＞0.05）。　　2.2 C1GALT1位点测序及基因频率分布　　2.2.1 Rs9639031位点测序结果　　rs9639031 位点具有 C/T 二肽性，纯化测序结果显示，rs9639031 有三种基因分型：CC 型、TT 型和CT 型。IgAN 组、汉IgAN组及对照组三种基因分型分布均符合H-W平衡定律。　　维吾尔IgAN组及汉IgAN组CC频率高，CT 和 TT 频率较低。对照组则相反。三组间基因型频率无统计学差异（P＞0.05）；见表2。　　维吾尔Ig AN组及汉IgAN组C频率高，T较低，对照组相反。三组间等位基因频率无统计学差异（P＞0.05）。见表2。　　分层分析：维吾尔IgAN组及汉IgAN组C等位基因频率均稍高于对照组，相比于T未发现C与维吾尔IgAN组及汉IgAN组的IgAN发病相关（P＞0.05）；　　维吾尔IgAN组及汉IgAN组的CC型频率比对照组高，与TT相比较没发现 CC与维吾尔IgAN组及汉IgAN组的IgAN发病相关（P＞0.05）；维吾尔IgAN的CT 型较对照组稍低，与 TT相比， CT型与维吾尔IgAN组及汉IgAN组的发病也不相关（P＞0.05）。见表2。　　2.2.2 Rs5882115位点测序结果　　通过测序得出，此位点有 3 种基因分型：DD缺失纯合型、DI杂合子型、II插入纯合型。　　维吾尔IgAN 组、汉IgAN组及对照组基因型分布符合 Hardy-Weinberg 平衡定律。　　维吾尔IgAN组和汉IgAN组DI和II基因型频率均较高，DD频率较低，对照组与之相反，维吾尔IgAN组和汉IgAN组与对照组基因型频率相比，均有统计学差异（P＜0.05）。维吾尔IgAN组和汉IgAN组基因型频率相比，无统计学差异（P＞0.05）。　　维吾尔IgAN组I频率18.3%，D 81.7%，汉IgAN组I频率16.1%，D 83.9%，对照组分别是8.3%和91.7%。维吾尔IgAN组和汉IgAN组与对照组等位基因频率比较，均有统计学差异（P＜0.05）。维吾尔IgAN组和汉IgAN组等位基因频率相比，无统计学差异（P＞0.05）。　　分层分析， 维吾尔IgAN组及汉IgAN组的I等位基因频率稍高于对照组，与D相比，发现 I可能与维吾尔IgAN组（OR=2.469，P=0.005）及汉IgAN组（OR=2.562， P=0.004）的IgAN发病相关。　　维吾尔IgAN组及汉IgAN组DI 和 II 基因型频率比对照组高，分别与 DD相比，发现DI可能与 维吾尔IgAN （OR=2.874， P=0.004）和汉IgAN（OR=3.146， P＜0.001）的发病相关，表明维吾尔IgAN组及汉IgAN组DI基因型比DD患Ig AN的危险性分别高 2.874和3.146倍。维吾尔IgAN组及汉IgAN组II与DD比较，II与两组Ig AN的发病无相关性（P＞0.05）。　　病理分级高的IgA肾病rs5882115基因DI基因型的频率明显高于DD、II，差异具有统计学意义（χ2=5.214，P=0.012）；病理分级高的IgA肾病I基因等位基因的频率明显高于D，差异具有统计学意义（χ2=6.024，P=0.008）。　　2.2.3 C1GALT1基因Rs1008898位点测序分型结果　　C1GALT1 基因 rs1008898 位点A/G 二态性，PCR 扩增产物纯化测序后，该位点具有三种基因分型：AA 型、AG 型、GG 型。　　维吾尔IgAN 组、汉IgAN组及对照组各基因型分布符合 Hardy-Weinberg 平衡定律。　　维吾尔IgAN组及汉IgAN组AA、AG基因型频率较高，GG频率较低；对照组相反，IgAN 组、汉IgAN组及对照组基因型频率无统计学差异（P＞0.05）。　　维吾尔IgAN 组、汉IgAN组及对照组三组等位基因频率分布中，维吾尔IgAN组和汉IgAN组A基因频率分别为45.0%、，G频率分别为55.0%、；对照组分别是37.8%和 62.2%。维吾尔IgAN 组、汉IgAN组及对照组三组等位基因比较无统计学差异（P＞0.05）。　　分层分析，IgAN组和A 等位基因频率高于对照组，与G相比，未发现 A与维吾尔Ig AN及IgAN汉的发病相关（P＞0.05）；IgAN组和汉IgAN组中AG基因型频率较对照组高，与GG比较，均未发现AG与维吾尔IgAN及汉IgAN的发病相关（P＞0.05）；维吾尔IgAN组和汉IgAN组中AA频率比对照组高，与GG比，AA与维吾尔IgAN组和汉IgAN组IgAN的发病均不存在相关性（P＞0.05）。　　2.3 ST6GALNAC2位点测序及基因频率分布　　2.3.1-988A＞G 位点测序分型结果　　-988A＞G 位点具有 A/G 二态性，通过对 PCR 扩增产物纯化测序，该位点具有三种基因分型：AA 型、 AG 型、GG型。　　维吾尔IgAN 组、汉IgAN组及对照组各基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。　　维吾尔Ig AN组及汉IgAN组AA、AG基因型频率高，GG频率较低；对照组则相反；IgAN 组、汉IgAN组及对照组三组基因型频率无统计学差异（P＞0.05）。　　维吾尔IgAN组及汉IgAN组A 等位基因频率较高，G较低，对照组则相反，IgAN组、汉IgAN组及对照组间等位基因频率间无统计学差异（P＞0.05）。　　维吾尔IgAN组和汉IgAN组中 AG 基因型频率比对照组高，与GG基因型比较，均未发现AG基因型与维吾尔IgAN组和汉IgAN组Ig AN的发病存在相关性（P＞0.05）；维吾尔Ig AN和汉IgAN组中AA基因型频率比对照组高，与GG基因型相比， AA 基因型与维吾尔IgAN组和汉IgAN组IgAN 的发病可能都不存在相关性（P＞0.05）　　2.3.2 Rs1867561位点测序结果　　rs1867561 位点具有 C/G 二态性，纯化测序PCR 扩增产物后，有三种基因型：CC 、CG 、GG 。　　维吾尔IgAN 组、汉IgAN组及对照组基因型分布符合H-W平衡定律。　　维吾尔Ig AN组和汉IgAN组CG、GG基因型频率较高，CC较低，对照组相反，维吾尔Ig AN组和汉IgAN组基因型频率较对照组均有统计学差异（P＜0.05）。维吾尔IgAN组和汉IgAN组基因型频率相比，无统计学差异（P＞0.05）。　　维吾尔IgAN组和汉IgAN组G等位基因频率较高，C稍低，对照组则相反，维吾尔Ig AN组和汉IgAN组等位基因频率较对照组均有统计学差异（P＜0.05）。维吾尔IgAN组和汉IgAN组等位基因频率相比，无统计学差异（P＞0.05）。　　分层分析，维吾尔IgAN组和汉IgAN组G基因频率均较对照组高（OR=2.034， P=0.001；OR=2.457，P=0.014），提示G可能与维吾尔IgAN组和汉IgAN组Ig AN的发病相关。维吾尔IgAN组和汉IgAN组携带G等位基因较携带C的人，发生Ig AN的风险分别高2.034 倍和2.457倍。　　维吾尔Ig AN组和汉IgAN组CG、GG基因型频率比对照组高，分别与CC比较，维吾尔Ig AN组和汉IgAN组CG与Ig AN的发病相关（OR=2.273，P=0.012；OR=3.142，P=0.008），即维吾尔Ig AN组和汉IgAN组携带CG的较CC患IgAN危险性分别高2.273倍和3.142倍；维吾尔Ig AN组和汉IgAN组GG与CC比较提示：GG与维吾尔Ig AN组和汉IgAN组IgAN发病也相关（OR=3.979，P=0.012；OR=2.831，P=0.016）即维吾尔Ig AN组和汉IgAN组携带GG的人较CC患Ig AN的危险性分别高 3.979 倍和2.831倍。　　病理分级高的IgA肾病rs1867561基因CG基因型的频率明显高于DD、II，差异具有统计学意义（χ2=5.025，P=0.015）；病理分级高的IgA肾病G基因等位基因的频率明显高于C，差异具有统计学意义（χ2=6.125，P=0.007）。　　结论：　　（1）C1GALT1 基因 rs5882115 位点多态性可能与新疆 IgA肾病存在相关易感性，其中基因型DI和等位基因I可能为维吾尔族Ig A肾病危险因素；　　（2）ST6GALNAC2基因rs1867561位点多态性可能与新疆Ig A肾病存在相关易感性，其中基因型GG、CG及等位基因G可能为维吾尔族Ig A肾病危险因素；　　（3）rs9639031、rs1008898和-988A＞G位点多态性与维吾尔族Ig A肾病易感性无明显相关。　　（4）C1GALT1 基因 rs5882115 与ST6GALNAC2 基因 rs1867561位点多态性可能与新疆地区Ig A肾病的严重程度相关。　　（5）新疆地区维吾尔族和汉族Ig A肾病的在各基因位点的基因型及等位基因频率均无显著差异，即无明显种族差异。

目录

声明

缩略词表

前言

材料和方法

一 、新疆地区维吾尔族IgA肾病患者三个糖基化关键酶编码基因多态性研究

（一）材料

（二）方法

二、候选基因SNPs与IgA肾病的关联研究

（一）研究对象的选择

（二）主要试剂和仪器

（三）方法

（四）数据分析和统计

结果

一、参考样本筛查SNP

二、候选基因的关联研究

（一）入选研究对象的-般状况

（二） C1GALT1 基因各位点的测序分型结果、基因型和等位基因的频率分布

（三）ST6GALNAC2 基因各位点的测序分型结果、基因型和等位基因的频率分布

讨论

参考文献

综述IgA1异常糖基化在IgA肾病发病机制中的研究进展

攻读学位期间发表论文

致谢