胚胎干细胞定向分化为神经上皮干细胞和皮层投射神经元的体系建立

摘要

在胚胎发育过程中，脊索诱导其背侧中线的外胚层（神经外胚层）形成神经板并发育成神经管。紧接着神经管闭合，管腔特化成脑室，背部区域特化成端脑。当端脑起始发育的时候，组成神经管的神经上皮干细胞，不断的增殖扩增，逐渐转变为放射状胶质前体细胞，最后这些胶质前体细胞进行迁移分化最终形成了大脑皮层。
　　神经管发育异常将导致一系列疾病。因此，利用多能性干细胞，发展一种灵长类神经管发育模型，能够帮助我们研究神经管疾病。本研究建立了一种稳健的体系，该体系能够在单细胞水平上进行克隆扩增并形成微小的类神经管结构;另外，单细胞不仅能够在体外产生功能神经元，还能在体内存活并广泛再生神经元轴突;除此之外，本研究还发现神经上皮干细胞特性的维持与类神经管结构的形成依赖高能量代谢;通过Notch信号与细胞粘附分子来调控Wnt信号通路，单个神经上皮干细胞能够转变为放射状胶质前体细胞;最后，利用“NESC-TO-NTs”体系，本研究成功模拟了叶酸在神经管闭合过程中的作用，表明叶酸可以调控多种机制预防神经管疾病。可见，本研究建立了一个能够在体外研究神经管发育和疾病理想的体系。
　　大脑皮层是大脑中最复杂的结构之一，其损伤会导致一系列的神经发育和神经退行性疾病。在结构上，大脑皮层可以分为6层，第1层为cajal细胞层，2、3、4层为上层投射神经元，5、6层为底层投射神经元。根据神经元的位置和突触连接方式，5、6层又称为离皮质投射神经元。离皮质投射神经元的分化方法缺乏，限制了研究其在大脑皮层中的发育和功能。本研究开发了“两步法”能够从人胚胎干细胞快速诱导离皮质神经元:(1)诱导胚胎干细胞转变为神经上皮干细胞;(2)神经上皮干细胞分化产生80％的高纯度离皮质投射神经元。本方法获取的神经上皮干细胞不但能够在单细胞水平进行长时问的自我更新并自我重组形成类神经管结构，还能够稳定的分化为离皮质投射神经元和中间神经元。另外，本研究还发现:移植的神经上皮干细胞能成功整合到小鼠脑中，并分化为投射神经元，从而建立有效的突触连接和特殊的投射模式。因此，有效的产生离皮质投射神经元，能够促进人们了解大脑皮层的发育机制，并为细胞治疗提供充足的储备资源。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 胚胎干细胞

1．1．1 胚胎干细胞的发现与历史

1．1．2 胚胎干细胞的生物学特性

1．1．3 胚胎干细胞的应用

1．2 神经干细胞

1．2．1 神经干细胞

1．2．2 成体神经干细胞的分布

1．2．3 神经干细胞的发育

1．2．4 神经干细胞的分类

1．2．5 神经干细胞的体外培养

1．2．6 神经上皮干细胞的特性

1．2．7 神经管(Neural tube，NT)的发育形成

1．2．8 神经管神经干细胞的增殖和形态

1．2．9 神经干细胞在疾病中的功能

1．2．10 潜在的应用价值

1．3 大脑皮层

1．3．1 大脑皮层

1．3．2大脑皮层的细胞结构

1．3．3大脑皮层的发育

1．3．4 皮层前体细胞类型

1．3．5 皮层前体细胞的潜在临床应用价值

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物及细胞

2．1．2 主要溶液配制

2．2 方法

2．2．1 细胞的冻存与复苏

2．2．2 MEFs的分离培养及饲养层的制备

2．2．3 胚胎干细胞的培养

2．2．4 神经上皮干细胞(NESC)诱导

2．2．5 神经上皮干细胞(NESC)的传代培养

2．2．6 单细胞克隆实验

2．2．7 胶质细胞的准备

2．2．8 神经上皮干细胞分化

2．2．9 NESCs向大脑皮层神经元分化

2．2．10 神经元的电生理膜片钳记录

2．2．11 神经上皮干细胞修饰由于叶酸缺乏导致的神经管缺陷

2．2．12 细胞免疫化学染色

2．2．13 质粒的准备

2．2．14 病毒的包装

2．2．15 质粒的电转

2．2．16 RNA的提取

2．2．17 RNA反转录为CDNA

2．2．18 细胞的移植

2．2．19 灌流

第三章 建立神经上皮干细胞培养体系，模拟神经管发育和疾病研究

3．1 研究背景和目的

3．2 实验结果

3．2．1 胚胎干细胞

3．2．2 胚胎干细胞快速诱导成神经上皮干细胞，NESCs在体外长时间进行自我更新并维持其特性

3．2．3 单个神经上皮干细胞自我重组形成类神经管结构

3．2．4 单个神经上皮干细胞在体外产生功能神经元并广泛整合到大脑皮层

3．2．5 NESCs向RGPC转变依赖WNT信号通路以及控制NESC-To-NTs的机制

3．2．6 “NESC-TO-NTs”神经管模型模拟叶酸缺失的NTD

3．3 讨论

第四章 利用神经上皮干细胞分化高纯度的皮层投射神经元

4．1 研究背景和目的

4．2 实验结果

4．2．1 人胚胎干细胞快速转变为神经上皮干细胞(NESCs)

4．2．2 NESCs在体外产生成熟神经元

4．2．3 NESCs分化为大量离皮质投射神经元和少量中间神经元

4．2．4 单个NESCs以同样的方式产生皮层离皮质神经元和少量的中间神经院

4．2．5 NESCs广泛整合到新生小鼠脑中

4．2．6 NESCs在体内分化为离皮质神经元和中间神经元

4．3 讨论

参考文献

致谢

在读期间完成的学术论文与取得的研究成果