植物激素脱落酸的受体蛋白PYL8和PYL9通过结合转录因子MYB家族成员调控拟南芥的侧根生长

摘要

植物的根系对植物的营养吸收和胁迫响应有着不可替代的作用。生长素(Auxin)是一类重要的植物激素，在促进植物主根和侧根生长发育等方面的作用尤其显著。脱落酸(ABA: Abscisic acid)是另外一类重要的植物激素，它在植物的生长，发育，衰老以及胁迫响应等方面都有着非常重要的作用，常被认为是植物根系生长的抑制因子。PYR1/PYLs/RCARs蛋白家族是目前被广泛认可的植物脱落酸受体，这个蛋白家族共有14个成员，在脱落酸存在的情况下，它们可以和一类蛋白磷酸酶(clade-A PP2C: clade-A Protein Phosphatase2C)发生相互作用，使得原本和这类磷酸酶结合的蛋白激酶（SnRK2: Sucrose non-fermenting-1-Related protein Kinase2）从其上解离，从而使SnRK2激酶可以发生自磷酸化并且重新获得活性，然后进一步磷酸化下游基因，比如ABF2，使得脱落酸信号得以快速的向下传递并且调控相关基因的表达量上升或者下降。脱落酸的受体家族中的部分成员还在其他方面有着重要作用。比如PYL13，它对于PP2C的结合是不需要依赖脱落酸的，并且它还可以和其他PYL蛋白结合并抑制它们结合PP2C磷酸酶的能力，在实际应用方面，PYL13的过量表达会使得植物抗旱。不仅是PYL13，过量表达PYL5，也可以使植物抗旱。在所有的PYL单敲除突变体中，PYL8是唯一一个单敲除体在脱落酸培养基上表现出明显的主根伸长的表型的基因。
　　在盐胁迫以及外源施加脱落酸的情况下，拟南芥侧根生长将会进入静止期，而缺乏脱落酸受体PYL8会使得该静止期延长，与这一现象不同，四突变体pyr1pyl1/2/4和三突变体snrk2.2/3/6却表现出了缩短的静止期，说明PYL8在这一过程中起的作用是其特有的。我们发现pyl8静止期延长的表型可以被外源同时施加一种最常见的生长素，吲哚乙酸(IAA: Indoleacetic acid)所恢复。而对于和PYL8氨基酸序列非常相似的PYL9，发现它和PYL8的双敲除突变体的侧根静止期长于PYL8单敲除突变体，这一现象也可以被外源施加吲哚乙酸所逆转，但是需要的吲哚乙酸浓度高于pyl8单突变体恢复所需的浓度。另外，虽然pyl9的单突变体没有类似于pyl8的侧根生长受到脱落酸抑制的表型，但是PYL9的诱导过量表达会明显增加转基因植物的平均侧根长度，说明PYL8和PYL9在侧根调控方面的功能有一定程度的重叠，并且PYL9的功能弱于PYL8。酵母双杂交实验发现了PYL8和PYL9蛋白可以和MYB77等转录因子相互作用，体内实验进一步证实了这种相互作用调控了该转录因子下游的基因的功能。MYB77是ARF7的互作蛋白并能增强其活性，而ARF蛋白参与了生长素信号通路，说明MYB77是通过生长素信号通路来调控侧根的生长的。MYB77所在的R2R3MYB家族分为多个亚组，其中MYB77所在的第22亚组还包括MYB44，MYB70，MYB73。由于MYB转录因子本身是生长素信号通路的一部分，所以PYL蛋白通过MYB转录因子影响了生长素信号通路，实现了两种植物激素的交互影响，是脱落酸和生长素信号通路的交叉节点。因此，PYL8和PYL9在侧根从静止期恢复这一过程中起着重要作用，并且这一作用是通过调控MYB转录因子进而影响生长素信号通路。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 植物的根系构型

1．2 植物的根系和非生物胁迫

1．3 植物激素生长素的信号通路

1．4 植物激素脱落酸的信号通路

1．5 脱落酸受体的功能冗余和功能多样性

1．6 MYB蛋白家族

1．7 生长素对根系构型的作用

1．8 脱落酸对根系构型的作用

1．9 其他植物激素对侧根的作用

1．10 植物激素生长素和脱落酸的拮抗作用和协同作用

第2章 实验材料与方法

2．1 主要实验仪器和试剂盒

2．2 植物材料与生长条件

2．3 植物材料的无菌培养

2．4 拟南芥侧根以及主根的测量统计

2．5 遗传杂交实验

2．6 分子克隆

2．6．1 聚合酶链式扩增反应(PCR)

2．6．2 核酸的琼脂糖凝胶电泳及回收

2．6．3 Gateway克隆

2．6．4 酶切反应

2．6．5 T4连接体系

2．6．6 大肠杆菌感受态细胞的制备以及化学转化

2．6．7 菌落PCR鉴定阳性克隆

2．6．8 质粒的小量抽提

2．6．9 酶切鉴定阳性克隆

2．7 测序样品的准备

2．8 电击转化农杆菌以及农杆菌浸花转化拟南芥

2．9 拟南芥阳性苗的筛选

2．10 植物基因组的抽提以及纯合体鉴定

2．11 植物RNA的抽提

2．12 RNA的琼脂糖凝胶电泳

2．13 RNA的反转录

2．14 荧光定量PCR

2．15 拟南芥原生质体的瞬时转化

2．15．1 质粒大量抽提

2．15．2 拟南芥原生质体的制备及转化

2．16 酵母双杂交

2．17 染色体免疫共沉淀

2．18 植物总蛋白的粗略抽提

2．19 蛋白免疫沉淀实验

2．20 Western Blot实验

2．21 原核蛋白的表达

2．22 凝胶阻滞实验

第3章 脱落酸受体PYL8通过结合MYB转录因子进而调控植物侧根发育

3．1 实验结果

3．1．1 PYL8促进侧根从脱落酸的生长抑制中恢复

3．1．2 脱落酸对侧根的抑制是通过PYLs，PP2Cs，SnRK2s来实现的

3．1．3 在pyl8及脱落酸不敏感突变体中脱落酸对主根生长和侧根发生的影响

3．1．4 外源添加生长素促进pyl8突变体中被脱落酸抑制的侧根生长

3．1．5 PYL8通过增强MYB77的作用来调控侧根发育

3．1．6 PYL8同时增强了MYB77的同源蛋白的转录活性

3．2 实验讨论

3．2．1 脱落酸信号通路抑制侧根在静止期的生长

3．2．2 盐胁迫和施加脱落酸对植物侧根发育的作用机制

3．2．3 PYL8蛋白通过和MYB转录因子作用促进侧根离开静止期

3．2．4 脱落酸和生长素的协同作用

3．2．5 后续实验

第4章 脱落酸受体PYL9通过结合MYB转录因子进而调控植物侧根发育

4．1 实验结果

4．1．1 脱落酸处理下pyl8-1pyl9双突变体的主根和侧根发生的抑制程度比pyl8-1低

4．1．2 脱落酸处理下pyl8-1pyl9双突变体的侧根静止期长于pyl8-1

4．1．3 外源添加生长素可以促进pyl8-1pyl9双突变体中被脱落酸抑制的侧根生长

4．1．4 诱导表达PYL9蛋白引起主根和侧根的异常生长

4．1．5 PYL9蛋白和MYB转录因子相互作用

4．1．6 脱落酸和生长素可以促进PYL9增强MYB转录因子的转录活性

4．2 实验讨论

4．2．1 简要总结

4．2．2 侧根生长对脱落酸的超敏感揭示了脱落酸的一个重要功能

4．2．3 脱落酸诱导的侧根生长静止需要脱落酸受体介导其恢复

4．2．4 生长素和脱落酸的相互作用

4．2．5 后续实验

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果