高尔基体蛋白STK16和G蛋白GNG7在有丝分裂和膜转运中的功能研究

摘要

有丝分裂和膜转运异常是导致恶性肿瘤等疾病发生和发展的重要因素。近年来的证据表明，这两个看似相对独立的关键生命过程之间存在着某种紧密联系。然而至今，在有丝分裂和膜转运中起双重调控功能的蛋白及其调控机制研究相对匮乏，因此发现更多的、在两过程中均起关键调控功能的蛋白对于阐明肿瘤等疾病的发病机理有重要的指导意义。本文分别从高尔基体蛋白STK16激酶和Gγ蛋白GNG7入手，联合细胞生物学、生物化学和分子生物学等手段，深入探究两者在有丝分裂和膜转运中的功能及调控机制，获得的主要研究结果如下:
　　1.高尔基体蛋白STK16在有丝分裂和膜转运中的功能研究
　　STK16激酶主要定位于高尔基体和细胞膜上。高尔基体部分的STK16在间期时与高尔基体的中间膜囊标记蛋白Giantin共定位，而有丝分裂期时定位发生变化。STK16干扰或活性抑制后不仅推迟细胞进入分裂期，导致G2期细胞比例增高，而且细胞在分裂期的持续时间延长，前中期细胞和胞质分裂期细胞也大幅度增多。并且，STK16干扰或活性抑制后影响高尔基体在G2期和分裂前期的片段化，以及分裂后期高尔基体的重组装。进一步研究发现，STK16激酶可以与肌动蛋白actin直接结合，并以浓度依赖型和激酶活性依赖型形式调控actin的聚合和解聚动力学。因此，STK16激酶能直接通过调节actin的动态平衡影响高尔基体形态并调控细胞的有丝分裂进程。
　　VSVG-GFP质粒转染显示，STK16并不影响内质网到高尔基体以及高尔基体到细胞质膜之间的顺式转运。然而，STK16却参与了经典的胞吞、铁转运蛋白的胞内循环以及表皮生长因子受体的降解途径;并且，STK16在细胞质膜和早期内体、以及高尔基体和内体之间的膜转运以及自噬中发挥功能。
　　定点突变结果表明，肉豆蔻酰化和棕榈酰化修饰是STK16定位于细胞质膜和高尔基体的前提;两种修饰均可作用于STK16对actin的聚合动力学的调控、高尔基体形态和蛋白转运抑制剂刺激下的核质穿梭，提示STK16可能作为转录因子调控其他基因的表达和功能。
　　2.G蛋白GNG7在有丝分裂和自噬中的功能研究
　　报道显示，Gγ亚基成员GNG7在几种肿瘤细胞中低表达;通过半定量RT-PCR检测，也发现GNG7在多种肿瘤细胞中的转录本水平显著低于正常细胞，表明GNG7可能是一个抑癌蛋白。因此，在GNG7低表达的骨肉瘤和宫颈癌细胞中过表达GNG7蛋白，并比较生长曲线的变化，结果表明GNG7过表达后不仅细胞生长被抑制，而且细胞大量死亡。进一步结合流式细胞术、细胞周期同步化以及RNA干扰等技术，探讨GNG7抑制细胞生长的机制。结果显示，GNG7过表达和干扰均使细胞阻滞于分裂期，导致大量双核/多核细胞的产生/出现;并且，GNG7在分裂期特别是分裂后期高表达，这些均提示GNG7可能主要作用于胞质分裂期。在此基础上，分析GNG7对细胞骨架微丝的影响，结果表明GNG7可通过调控体内actin的动态平衡导致胞质分裂异常。
　　通过流式细胞术、细胞染色和免疫印迹等技术检测了GNG7促进细胞死亡的途径。结果显示，GNG7过表达会促进细胞凋亡和自噬。通过免疫共沉淀，筛选获得了自噬过程中与GNG7存在相互作用的蛋白，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR。进一步实验结果表明，GNG7还可作用于mTOR信号通路进而诱导自噬，其干扰会明显抑制mTOR抑制剂和EBSS饥饿引起的自噬潮变化。因此，GNG7对细胞生长的抑制和对自噬性死亡的诱导效应使其呈现出良好的抑癌效果。
　　一方面，本研究首次发现定位于高尔基体上的丝氨酸/苏氨酸激酶可与actin直接相互作用，并能通过调控高尔基体的形态和功能影响整个有丝分裂期，为丝氨酸/苏氨酸激酶家族在细胞分裂中的调控模式提供了借鉴;并且，STK16参与多条膜转运途径;另一方面，GNG7作为第一个被发现的参与细胞自噬的Gγ亚基，可与mTOR相互作用并正调控自噬，并可通过影响actin作用于有丝分裂。因此，STK16和GNG7作为调控有丝分裂和膜转运的枢纽蛋白，其作用机制研究为两大生命过程的紧密联系提供了有力的证据，也为下一步更深入地探讨奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 有丝分裂周期及其调控

1．1．1 有丝分裂周期概述

1．1．2 有丝分裂的调控

1．2 膜转运及其调控

1．2．1 顺式转运(anterograde trafficking)

1．2．2 逆向转运(retrograde trafficking)

1．2．3 细胞自噬

1．3 有丝分裂和膜转运的关联

1．4 在有丝分裂和膜转运中发挥双重功能的蛋白的研究意义

第二章 高尔基体蛋白STK16在有丝分裂和膜转运中的功能研究

2．1 研究背景

2．1．1 高尔基体蛋白的组成及功能概述

2．1．2 高尔基体蛋白在有丝分裂中的功能

2．1．3 Actin可介导高尔基体蛋白对高尔基体功能的作用

2．1．4 高尔基体蛋白在膜转运中的功能

2．1．5 高尔基体蛋白的脂肪酰化修饰和功能

2．1．6 高尔基体蛋白STK16研究进展

2．1．7 本章的主要研究内容

2．2 材料和方法

2．2．1 实验用载体、细胞株、抑制剂及试剂

2．2．2 表达质粒构建

2．2．3 病毒包装和稳转过表达细胞系筛选

2．2．4 细胞培养

2．2．5 野生型或突变体STK16单体和多聚体蛋白的表达和纯化

2．2．6 免疫荧光染色

2．2．7 免疫印迹

2．2．8 RNA干扰

2．2．9 免疫共沉淀

2．2．10 体外磷酸化实验

2．2．11 肌动蛋白体外聚合实验

2．2．12 肌动蛋白体外解聚实验

2．2．13 体外蛋白pull down实验

2．2．14 同步化实验

2．2．15 RT-PCR

2．2．16 扫描隧道显微镜(STM)

2．2．17 细胞周期测定

2．2．18 VSVG-GFP的顺式转运

2．2．19 铁转运蛋白(transferrin)胞吞

2．2．20 铁转运蛋白(transferrin)的体内循环

2．2．21 EGFR降解

2．2．22 统计学分析

2．3 实验结果

2．3．1 野生型、激酶失活型、RNAi耐受型和抑制剂耐受型STK16在细胞中的定位检测

2．3．2 STK16干扰效率的确定

2．3．3 STK16干扰或活性抑制同时增加G2期和有丝分裂期(M期)的细胞比例

2．3．4 STK16干扰或激酶活性抑制影响M期各时期细胞比例

2．3．5 STK16干扰或活性抑制延迟细胞进入分裂期并延长分裂期时间

2．3．6 STK16激酶调控高尔基体完整性

2．3．7 STK16可能通过actin影响高尔基体的重组装

2．3．8 体内STK16与肌动蛋白相互作用并调控F-actin的组装

2．3．9 野生型单体和二聚体／多聚体形式STK16蛋白的纯化和表征

2．3．10 STK16在体外以浓度和激酶活性依赖型形式调控actin的聚合和解聚

2．3．11 体外实验显示STK16与actin直接结合且与激酶活性不相关

2．3．12 脂肪酰化位点突变可能影响STK16蛋白的二聚化

2．3．13 酰化位点修饰对actin动力学的影响及其可能机制

2．3．14 酰化位点突变对体内STK16的定位、高尔基体完整性、F-actin和细胞周期的影响

2．3．15 酰化位点突变和激酶失活型突变影响STK16蛋白的核质穿梭

2．3．16 STK16不影响VSVG-GFP在细胞内的顺式转运

2．3．17 STK16参与铁转运蛋白的胞吞和体内循环

2．3．18 STK16影响体内EGFR的转运

2．3．19 STK16可能参与高尔基体-内体转运

2．3．20 STK16参与自噬

2．4 结果分析与讨论

第三章 G蛋白GNG7在细胞分裂和自噬中的功能研究

3．1 研究背景

3．1．1 G蛋白的组成及传统功能

3．1．2 Gα蛋白的非传统功能

3．1．3 Gβγ二聚体的传统和非传统功能

3．1．4 G蛋白与细胞自噬

3．1．5 GNG7研究进展

3．1．6 本章的主要研究内容

3．2 材料和方法

3．2．1 实验用载体、细胞株、抑制剂及试剂

3．2．2 细胞培养

3．2．3 表达质粒构建

3．2．4 病毒包装和稳转过表达细胞系筛选

3．2．5 免疫荧光染色

3．2．6 免疫印迹

3．2．7 RNA干扰

3．2．8 免疫共沉淀

3．2．11 细胞周期测定

3．2．12 细胞凋亡测定

3．2．13 细胞生长曲线测定

3．2．14 细胞老化检测

3．2．15 统计学分析

3．3 研究结果

3．3．1 GNG7过表达抑制肿瘤细胞生长

3．3．2 GNG7过表达将细胞阻滞于有丝分裂期

3．3．3 GNG7干扰诱导双核或多核细胞生成并降低细胞数目

3．3．4 GNG7在分裂期高表达

3．3．5 GNG7影响细胞内F-actin形成

3．3．6 GNG7过表达诱导细胞凋亡

3．3．7 GNG7过表达不会诱导细胞衰老

3．3．8 GNG7诱导自噬

3．3．9 GNG7通过与mTOR复合物相互作用诱导自噬

3．3．10 GNG7干扰降低Rapamycin和饥饿诱导的自噬潮

3．4 结果分析和讨论

结论与展望

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文及取得的其他学术成果