新型小分子化合物用于激活HIV潜伏病毒储存库的研究

摘要

人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，自1981年发现至今已有30多年，仍在严重威胁人类的健康。高效抗逆转录药物疗法（HAART）的发展有效控制了HIV患者病情的进展，使得HIV成为一种慢性病，一旦中断HAART治疗后，病毒会很快反弹，因此病人不得不终生服药。HIV难以治愈的主要原因是细胞中潜伏存在的病毒储存库。清除病毒储存库最有希望的策略之一是shock and kill，即先用药物激活潜伏HIV储存库的转录表达，然后利用机体免疫系统或细胞病变效应杀死这些激活后的感染细胞。目前已有多种类型的HIV病毒储存库激活剂正在研究开发中，例如IL-2、CD3单克隆抗体等会引起普遍的T细胞激活现象，但同时引起细胞毒性并且释放炎性因子;组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACis)丙戊酸钠(VPA)和环庚烷异羟肟酸(SAHA)也已被证明在体外可高效诱导HIV转录的，但其临床治疗效果不佳。因此研发新型的小分子化合物用以高效安全地激活HIV潜伏病毒储存库是非常有必要的。
　　吡喃并吲哚类化合物被广泛用于药物研发，它已被证明具有抗炎、抗肿瘤、抗细菌感染等生物活性。在先前的工作中，我们的合作者发展了一种高效合成二氢吡喃吲哚衍生物的有机催化合成方法，得到了一系列吡喃并吲哚类化合物。在本研究中，我们对这些化合物可能的生物活性进行了研究。首先使用细胞模型—J-lat A10.6细胞系，对这些化合物进行了筛选以发现可能的病毒储存库激活剂。通过细胞模型筛选实验以及化合物结构优化改造，我们最终证实化合物GIBH-LRA002（2-氨基-3-氰基-9-甲基-4-（三氟甲基）-4，9-二氢吡喃并[2，3-b]吲哚-4-羧酸乙酯）具有最优的激活效果。由于细胞系潜伏感染模型并不能很好地代表艾滋感染者体内的病毒储存库情况，因此我们进一步验证了该化合物对SIV感染猕猴和HIV患者体内CD4+T细胞中潜伏病毒储存库的激活效果，研究结果表明了GIBH-LRA002可有效的激活这些原代CD4+T细胞中潜伏病毒储存库。此外，我们的研究也发现GIBH-LRA002对细胞活性没有显著影响。还初步证明了GIBH-LRA002不会导致T细胞的非特异活化，这将有利于阻止CD4+T细胞的过度活化，从而可降低病毒储存库激活后产生的新生病毒颗粒的扩散。总之，本研究表明了GIBH-LRA002对HIV潜伏病毒储存库有良好的激活效果，且不会引起明显的细胞毒性和非特异激活，是一个值得深入研究的HIV病毒储存库激活候选药物。本论为将对HIV的治愈或功能治愈提供重要参考。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 HIV病毒结构

1．2 HIV流行病学

1．3 HIV病毒储存库

1．3．1 HIV难以治愈的原因以及治疗艾滋病的进展

1．3．2 HIV病毒储存库的来源

1．3．3 研究潜伏储存库的模型

1．3．4 潜伏储存库建立以及长期维持的机制

1．4 功能性治愈的策略

1．5 HIV病毒储存库激活剂的研究现状

1．6 研究目的、基础和假设

1．7 技术路线

第2章 实验材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞

2．1．2 化合物和刺激药物

2．1．3 耗材和试剂

2．1．5 本课题所用流式抗体

2．1．4 本课题所用引物

2．1．6 本课题所用实验仪器

2．1．7 分析作图软件

2．1．8 各种培养基的配制方法

2．1．9 实验动物

2．2 实验方法

2．2．2 化合物对J-Lat A10．6细胞的激活检测方法

2．2．3 Ficoll法分离恒河猴外周血淋巴细胞(PBMc)

2．2．4 磁珠分选恒河猴CD4+T细胞

2．2．5 制备msRNA和usRNA标准品

2．2．6 细胞活力检测方法

2．2．7 一步法荧光定量PCR方法

2．2．8 提取细胞内RNA方法

2．2．9 细胞表面激活maker的检测方法

第3章 实验结果和讨论

3．1 筛选得到可高效激活HIV病毒储存库的吡喃并吲哚类小分子化合物

3．1．1 吡喃并吲哚衍生物的合成、结构改造及活性筛选

3．1．2 筛选出高激活活性的化合物

3．1．3 小结

3．2．1 GIBH-LRA002有效激活SIV病毒储存库

3．2．2 GIBH-LRA002有效激活HIV患者CD4+T细胞中病毒储存库

3．2．3 GIBH-LRA002有效激活HIV患者单核细胞病毒储存库

3．2．4 小结

3．3．2 GIBH-LRA002不会引起T细胞的非特异激活

3．3．3 小结

第4章 全文总结

参考文献

致谢

附录

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果