拟南芥RALF多肽家族的生物信息学初步分析及转基因植物的构建

摘要

快速碱化因子(Rapid Alkalinization Factor, RALF)作为受体介导的信号载体在植物防御和发育的调节中起关键作用，是一类在植物界保守地、能抑制氢泵活性从而调控细胞伸长的重要多肽激素。植物在分类成单子叶植物和双子叶植物之前就存在RALF蛋白家族，可能行使不同功能。拟南芥数据库中可检索到39种RALF基因，除了部分RALF功能和机制研究较为清楚之外，大部分的结构、和生物学功能并不清楚。为了比较不同RALF的生物学功能差异，本课题首先拟通过生物信息学的方法对拟南芥不同RALF的理化性质、蛋白结构进行初步分析。然后构建RALF基因的过表达载体，建立拟南芥缺失突变体和过表达转基因植株材料，观察拟南芥突变体的表型，研究拟南芥不同RALF基因的功能。通过本论文的研究，我们得到主要实验结果如下：　　(1)对拟南芥RALF家族的理化性质进行了预测的归纳分析。结果显示大多数拟南芥RALF蛋白的分子量、亲水性、正/负电荷残基数、pI值、不稳定系数、脂肪系数等理化性质较为相似，但RALF23和RALF34具有较大的相对分子质量。除了AT2G32788蛋白为疏水性蛋白，其余的38种RALF蛋白皆为亲水性蛋白，有27个蛋白质属于不稳定蛋白质，AT2G32788、RALF14、RALF25具有较大的脂肪指数，表明RALF家族在具有诱导植物组织间碱化的功能同时，某些蛋白还具有独特的生理生化功能。　　(2)对拟南芥RALF家族的序列相似性和亲缘关系进行了分析。结果显示利用系统发育树将拟南芥RALF家族的39个成员分成6类，基因点阵图检验结果显示该分类与功能密切相关，保守基序分析分析显示motif1和motif2在6类RALF中均保守，Logo分析表明半胱氨酸在维系RALF生物功能中可能发挥着重要的作用，SignalP4.1分析显示90%的RALF蛋白均存在信号肽。　　(3)拟南芥RALF基因T-DNA插入突变体的鉴定和部分RALF过表达植株的构建和鉴定。对从ABRC网站上购买拟南芥328株插入突变体进行3引物法鉴定，获得ralf1、ralf3、ralf4、ralf6、ralf7、ralf12、ralf17、ralf20、ralf21、ralf23、ralf27、ralf30和ralf33等13种纯合突变体，定量PCR结果显示纯合体种13种RALF表达量分别显著降低。构建并获得了RALF1-OE、RALF6-OE、RALF7-OE、RALF17-OE、RALF20-OE、RALF23-OE、RALF31-OE、RALF33-OE等8种过表达植株(每种植株都有2种以上的株系)，定量PCR结果显示相应RALF的表达量均显著增加。　　(4)拟南芥部分ralf缺失突变体表型的初步分析。对鉴定到的13种纯合突变体的表型进行了初步分析，结果显示ralf1、ralf23和ralf33缺失突变体中根毛减少，根长变长并提前抽苔；拟南芥ralf17缺失突变体的莲座叶叶片小，植株矮小，生长缓慢；除ralf17外，其他12种突变体种WRKY53、PDF1.2和FRK1等抗逆标记基的因表达量均有不同程度地上调。根部接种内生真菌后，拟南芥ralf1和ralf33缺失突变体的真菌量都有不同程度的减少。利用RALF1处理野生型拟南芥会导致RALF1、RALF31的基因表达显著下调。　　综上所述，39种拟南芥RALF基因家族虽然大都具有相类似的理化特性和相近的亲缘关系，但是不同RALF基因发挥不同功能，某些RALF基因调控植物细胞发育和生长，某些RALF基因调控植物免疫与抗逆，RALF基因不同程度地影响植物表型和植株抗胁迫的能力。并且，不同RALF基因表达之间也存在联系。

目录

声明

缩略词

第1章 绪 论

1.1多肽分子的研究进展

1.1.1多肽分子的分类

1.1.2多肽分子的加工

1.2 RALF多肽家族的研究进展

1.2.1 RALF多肽的发现

1.2.2 RALF多肽的分类

1.2.3 RALF多肽的结构

1.2.4 RALF多肽的功能

1.3本论文的研究目的和意义

第2章 拟南芥RALF基因家族的生物信息学分析

2.1实验材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2 实验方法

2.2结果与分析

2.2.1拟南芥RALF基因家族蛋白质的理化性质分析

2.2.2拟南芥RALF基因家族蛋白质的多序列比对和系统发育进化树

2.2.4拟南芥RALF基因家族的保守序列基序

2.2.7 拟南芥序列保守性Logo分析

2.2.5拟南芥RALF蛋白卷曲螺旋预测

2.2.6拟南芥RALF的信号肽预测

2.2.7拟南芥RALF家族的结构同源性检测

2.3 本章小结

第3章 拟南芥不同RALF基因过表达载体的构建及突变体材料的获得

3.1 实验材料和方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2 结果和分析

3.2.1拟南芥RALF基因T-DNA 插入纯合突变体植株的鉴定

3.2.3拟南芥不同RALF过表达载体的鉴定

3.3 本章小结

第4章 拟南芥部分ralf缺失突变体表型分析

4.1实验材料和方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 拟南芥ralf缺失突变体根部表型

4.2.2 拟南芥 ralf缺失突变体逆境中的表型

4.2.3 拟南芥ralf缺失突变体抗性基因的表达

4.2.4 拟南芥ralf缺失突变体定植的真菌量减少

4.2.4 RALF1蛋白处理拟南芥会使同基因家族RALF表达量下调

4.3本章小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

附录B 攻读学位期间其他方向研究

致谢