拟南芥F-box蛋白FKF1通过调控赤霉素信号控制开花的分子遗传学与生化分析

摘要

开花是植物生长发育过程中的一个重要阶段，是高等植物由营养生长阶段向生殖生长阶段转化的中心枢纽。该过程受到多种内在及外在因素影响，从而形成多条开花途径。在模式植物拟南芥中至少存在六种开花调控途径：光周期途径，春化途径，温度途径，赤霉素途径，自主途径和年龄途径。这几种开花调控途径既独立又相互联系，共同调控植物在合适的时间开花。研究各个开花途径之间的交叉会话，将使我们更好的了解植物开花的精密调控机制。　　F-box蛋白FKF1(FLAVINBINDING KELCH REPEAT F-BOX1)是拟南芥中重要的光周期开花调控因子。有研究表明，fkf1突变体在长日照条件下表现为晚开花，用外源赤霉素Gibberellin(GA)处理可以使fkf1突变体正常开花。为探究FKF1与GA调控开花通路之间的联系机制，本论文比较了FKF1过表达株系35S-GFP-FKF1和突变体fkf1-1，fkf1-t植物开花、种子萌发、幼苗下胚轴伸长对外源GA的响应；分析了fkf1突变体中GA合成和代谢关键基因的表达量及植物体内活性GA4的含量；研究了FKF1与GA信号通路关键抑制因子DELLA之间的相互作用和遗传关系。具体研究结果如下：　　(1)为了探究FKF1与GA调控的开花通路之间的联系，分析了GA处理对FKF1过表达株系35S-GFP-FKF1和突变体fkf1开花的影响，发现35S-GFP-FKF1开花对GA的敏感性增强，fkf1突变体的敏感性减弱，说明FKF1正调控植物开花对GA响应。同时，发现fkf1突变体种子萌发和下胚轴伸长对GA合成抑制剂paclobutrazol(PAC)更加敏感，下胚轴伸长对GA的敏感性减弱。这表明FKF1正调控植物对GA的响应。　　(2)为了研究FKF1正调控植物对GA的响应的具体机制，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)比较分析GA响应、合成和代谢关键基因在拟南芥野生型和fkf1突变体中的表达，发现与野生型相比，GA响应基因(EXP8和PRE1)在fkf1突变体中的转录表达下调，并且对PAC处理更加敏感；同时，发现GA代谢基因GA2oxs(GA2ox1，GA2ox2，GA2ox4和GA2ox6)在fkf1突变体中的表达下调，GA合成基因GA3ox2的表达上调。通过测量生物活性GA4的含量，发现fkf1突变体与野生型之间无明显差异。这表明FKF1可能通过促进GA信号转导而不是GA合成来正调控植物对GA的响应。　　(3)为了研究FKF1是否能够通过GA信号关键负调控因子DELLA蛋白影响植物开花对GA的响应，采用Western杂交实验分析比较野生型、fkf1突变体和35S-GFP-FKF1过表达植物中DELLA蛋白RGA的水平，发现内源RGA蛋白和TAP-RGA转基因蛋白在fkf1突变体中的稳定性增强，而在35S-GFP-FKF1过表达植物中的稳定性则降低；检测RGA蛋白和TAP-RGA转基因蛋白在长日照下的节律表达，发现FKF1调控RGA蛋白的节律累积，促进RGA蛋白在下午时段(照光8-12h)的降解。这说明FKF1负调控DELLA蛋白RGA的稳定性和节律积累。　　(4)为了研究FKF1是否直接调控DELLA蛋白的稳定性，采用酵母双杂交，双分子荧光互补(BIFC)，免疫共沉淀(Co-IP)和体外蛋白结合(GST pull down)实验分析，发现FKF1能够与DELLA蛋白RGA和GAI在体外体内直接互作。利用293T细胞系统进行Co-IP分析发现，FKF1与DELLA蛋白的相互作用不依赖于蓝光。进一步通过酵母双杂交及GSTpulldown分析，发现FKF1的Kelch重复结构域与DELLA的GRAS结构域是两者互作的位点。这说明FKF1与DELLA蛋白直接相互作用，且不依赖于蓝光。　　(5)为了研究FKF1能否调控DELLA蛋白的泛素化降解，利用烟草系统分析FKF1对DELLARGA和GAI蛋白泛素化的影响，发现FKF1能够促进RGA和GAI蛋白的泛素化。利用无细胞体系和烟草系统分析FKF1对RGA和GAI蛋白稳定性的影响，发现FKF1能够通过26S蛋白酶体途径促进RGA和GAI蛋白的降解。同时，利用拟南芥体系分析FKF1介导的RGA蛋白泛素化降解对蓝光的响应，发现FKF1对RGA蛋白的泛素化降解作用不依赖于蓝光。这说明FKF1促进DELLA蛋白的泛素化降解，且不依赖于蓝光。　　(6)为了进一步研究FKF1与DELLA蛋白在调控开花中的关系，利用遗传学分析发现，长日照条件下，与fkf1-1单突变体相比，rga-28/gai-t/fkf1-1开花提前了12.8天，叶片数目明显减少，说明rga-28和gai-t突变能够部分恢复fkf1-1突变体的晚花表型，rga-28/gai-t/fkf1-1三突变体中开花整合基因FT，SOC1和LFY的表达量明显增加。同时，发现35S-FKF1-Myc能够部分恢复35S-RGA-Flag和35S-GAI-Flag晚花表型和开花基因FT、SOC1和LFY的表达。说明FKF1部分通过调控DELLA蛋白的稳定性促进植物开花。　　(7)为了检测FKF1是否受到GA和DELLA的调控，采用qRT-PCR和Western杂交实验分析，发现GA处理能够抑制FKF1的转录表达，但不影响FKF1的转录后水平。进一步分析DELLA缺失突变体、功能获得突变体和过表达植物中FKF1的转录水平，发现DELLA能够诱导FKF1的转录表达，且GA处理对FKF1转录水平的抑制依赖于DELLA蛋白。这表明DELLA反馈促进FKF1的表达。

目录

声明

英文缩略词

第1 章绪论

1.1 模式植物拟南芥开花分子机理

1.1.1光周期途径

1.1.2春化途径

1.1.3自主途径

1.1.4赤霉素途径

1.1.5温度途径

1.1.6年龄途径

1.2 F-box基因的功能

1.2.1 F-box蛋白结构

1.2.2植物体内F-box基因家族的功能

1.3 FKF1/ZTL/LKP2 蛋白家族的功能

1.3.1 FKF1/ZTL/LKP2蛋白结构

1.3.2 FKF1/ZTL/LKP2功能

1.4本论文工作设想

第2 章 FKF1 对植物开花过程中GA 信号转导的调控研究

2.1实验所用材料与实验方法

2.1.1实验材料

2.1.2拟南芥种子消毒及培养

2.1.3拟南芥植物DNA的提取

2.1.4基因克隆与载体构建

2.1.5拟南芥的转化与转基因植株的筛选

2.1.6植物蛋白的提取和免疫印迹（Western blotting）

2.1.7植物总RNA提取

2.1.8 RNA的逆转录

2.1.9实时荧光定量PCR

2.1.10 GA含量分析

2.2结果与分析

2.2.1 FKF1基因的突变体及过表达植物的鉴定及开花表型分析

2.2.2 FKF1过表达株系35S-GFP-FKF1和突变体fkf1开花对GA的响应分析

2.2.3 ga1-3背景下FKF1基因的突变体植物开花对GA的响应分析

2.2.4 fkf1突变体种子萌发和下胚轴伸长对GA及PAC的响应分析

2.2.5 fkf1突变体中GA合成，代谢和下游响应基因表达量及体内活性GA4分析

2.3讨论

2.4本章小结

第3 章 FKF1 对GA 信号关键负调节子DELLA 蛋白稳定性的调控研究

3.1实验材料与方法

3.1.1拟南芥种子消毒及培养

3.1.2植物蛋白的提取和免疫印迹（Western blotting）

3.1.3酵母双杂交试验

3.1.4 双分子荧光互补（BIFC）实验

3.1.5 GST pull-down实验

3.1.6烟草免疫共沉淀（Co-IP）

3.1.7泛素化及体外降解实验

3.2结果与分析

3.2.1 FKF1 基因突变体及过表达植物中DELLA 蛋白RGA 稳定性分析

3.2.2 FKF1 基因突变体及过表达植物中DELLA 蛋白RGA 周期性变化分析

3.2.3 fkf1-1突变体中GA介导DELLA 蛋白RGA的降解分析

3.2.4 ga1-3背景下fkf1突变体DELLA蛋白RGA的稳定性分析

3.2.5 酵母双杂交检测FKF1/ZTL/LKP2与DELLA的相互作用分析

3.2.6 BIFC验证FKF1与DELLA的相互作用分析

3.2.7 免疫共沉淀（Co-IP）验证FKF1与DELLA的相互作用分析

3.2.8蛋白体外结合实验（GST Pull down）验证FKF1与DELLA的直接相互作用分析

3.2.9 FKF1与DELLA的相互作用位点分析

3.2.10 FKF1与DELLA的相互作用对蓝光的响应分析

3.2.11 FKF1促进DELLA蛋白的泛素化分析

3.2.12 FKF1调控DELLA蛋白的降解分析

3.2.13 FKF1介导的DELLA蛋白RGA的泛素化降解对蓝光的响应分析

3.3讨论

3.4本章小结

第4 章 FKF1 与DELLA 在开花通路中的遗传关系分析

4.1实验方法

4.1.1拟南芥中的消毒与培养

4.1.2拟南芥转化与转基因植株的筛选

4.1.3植物蛋白的提取与蛋白免疫印迹（Western blotting）

4.1.4 RNA的提取，逆转录及定量PCR

4.2结果与分析

4.2.1 RGA和GAI 基因的缺失能部分恢复fkf1-1突变体的晚花表型

4.2.2 FKF1基因的过表达能部分抑制RGA和GAI过表达植物的晚花表型

4.3讨论

4.4本章小结

第5 章 GA 和DELLA 对FKF1 基因表达的调控研究

5.1实验方法

5.1.1 RNA的提取，逆转录及定量PCR

5.1.2 植物蛋白的提取与蛋白免疫印迹（Western blotting）

5.2结果与分析

5.2.1 FKF1基因的转录水平受到GA的抑制

5.2.2 FKF1基因的转录水平受到DELLA的诱导

5.2.3 GA抑制FKF1的转录水平依赖于DELLA蛋白

5.2.4 FKF1的蛋白水平不受到GA调控

5.3讨论

5.4本章小结

结论与展望

1. 结论

2. 展望

参考文献

附录A（攻读博士学位期间发表的学术论文目录）

附录B 甘蓝型油菜BnGA2ox2基因在拟南芥及甘蓝型油菜中的表达及表型分析

B.1引言

B.2.1实验材料

B.2.2 BnGA2ox2 基因的克隆，拟南芥和油菜的转化

B.2.3 定量PCR（qRT-PCR）及蛋白分析

B.2.4种子萌发及下胚轴实验

B.2.5叶绿素及花青素含量测定

B.3 结果与讨论

B.3.1 甘蓝型油菜BnGA2ox2 基因的分离

B.3.2 BnGA2ox2 组织特性表达分析

B.3.3 过量表达BnGA2ox2 能够导致拟南芥和油菜矮化

B.3.4 过量表达 BnGA2ox2 能够导致拟南芥和油菜叶片中叶绿素和花青素累积

B.3.5 过量表达 BnGA2ox2 能够导致拟南芥部分败育，果荚变短以及种子萌发延迟

B.3.6 过量表达BnGA2ox2能够导致拟南芥开花延迟

B.3.7 AtGA2ox2基因的突变能够部分抑制BnGA2ox2基因过表达拟南芥的表型

B.4 讨论

B.5 结论

附录B参考文献

附录B英文缩略词

附录C

表 C.1 本研究中所用引物

表 C.2 附录B 研究中所用引物

表 C.3 附录B研究中所用序列的基因名字和GenBank号

致 谢