辛伐他汀干预BMSCs成骨分化早期β-catenin和pSmad1/5/8的蛋白表达情况的研究

摘要

目的：辛伐他汀是一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（3-hydroxy-3-methylglutaric acid，HMG-CoA）还原酶抑制剂，以往的大量实验已经证明辛伐他汀具有诱导成骨分化作用,但骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化早期的β-catenin和pSmad1/5/8蛋白表达情况尚未明确。本实验将就辛伐他汀（Simvastatin，SIM）体外给药对大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化早期的影响进行研究。探讨在成骨诱导成分环境下，辛伐他汀对骨髓间充质干细胞在成骨分化早期β-catenin和pSmad1/5/8蛋白水平的变化情况。　　方法：SPF级4周龄雌性SD大鼠20只，应用颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下取双侧股骨和胫骨，全骨髓培养法进行原代和传代培养。取第二代细胞随机分为4组，对照组（Control medium group，CM）：完全培养基培养；成骨诱导培养基组（Osteoinduce medium group，OM）：含有10mmol/Lβ甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸和10-8 mol/L地塞米松的成骨诱导培养基培养，作为阳性对照；辛伐他汀组（Simvastatin group，SIM）：只含有终浓度为10-7 mol/L辛伐他汀的完全培养基；辛伐他汀和成骨诱导培养基组（Simvastatin and Osteoinduce medium group，OM+SIM）：终浓度为10-7 mol/L的辛伐他汀和成骨诱导培养基。CM组和SIM组分别在2d、3d、4d、5d、6d做 MTT检测细胞增殖情况；CM组、OM组和OM+SIM组于给药1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h后，提取蛋白检测β-catenin和pSmad1/5/8的蛋白表达水平，第7d进行ALP染色。　　结果：1、MTT检测：10-7 mol/L浓度的辛伐他汀对细胞增殖和细胞活性无影响，差异不具有统计学意义（P>0.05）。2、ALP染色：可见OM组和OM+SIM组细胞胞浆内出现棕色颗粒，且OM+SIM组细胞胞浆内棕色颗粒肉眼观较 OM组明显染色增强，Kaplow积分法评分统计学分析差异具有统计学意义（P<0.05），CM组未见阳性显色。3、Western Blot检测：①β-catenin：组内不同时间点比较，OM、OM+SIM组内12h、24h、36h、48h与1h、2h、4h、8h相比β-catenin蛋白表达显著增高，统计学分析具有显著性差异（P＜0.05）。在同一时间点3组比较中，12h、24h和36h，OM+SIM组β-catenin蛋白表达量与OM组相比明显增高，统计学分析具有显著性差异（P＜0.05），48h的OM组和OM+SIM组与CM组相比具有统计学差异（P＜0.05）。②pSmad1/5/8：组内不同时间点比较中，OM组和OM+SIM组内8h、12h、24h、48h与1h、2h、4h、36h相比较，pSmad1/5/8蛋白表达明显增高，统计学分析具有显著性差异（P＜0.05）。在同一时间点3组比较中，8h、12h、48h，OM+SIM组与OM组相比pSmad1/5/8蛋白表达明显增高，统计学分析具有显著性差异（P＜0.05）。　　结论：10-7 mol/L浓度的辛伐他汀对细胞增殖和细胞活性无影响。第7d ALP染色，OM+SIM组较OM组ALP染色明显增强。辛伐他汀可以增加β-catenin蛋白和pSmad1/5/8蛋白表达量。

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引言

第1章 实验研究

1.1 材料与方法

1.1.1 实验动物SD大鼠

1.1.2 主要药品

1.1.3 主要试剂试剂名称

1.1.4 常用试剂的配制

1.1.5 主要仪器设备

1.1.6 骨髓基质干细胞的原代和传代培养

1.1.7 实验分组与加药

1.1.8 MTT

1.1.9 ALP染色

1.1.10 Westen Blot

1.1.11 统计学分析

1.2 结果

1.2.1 细胞培养形态观察

1.2.2 MTT

1.2.3 生物学特性检测

1.2.4 Western Blot

1.3 讨论

1.3.1BMSCs的分离培养及表型标志物

1.3.2 10-7mol/L辛伐他汀对细胞增殖影响及促进成骨的分析

1.3.3早期辛伐他汀干预BMSCs成骨分化β-catenin和pSmad1/5/8蛋白情况

1.4 结论

参考文献

第2章 综述BMP2信号通路与经典Wnt信号通路及相互交联对成骨分化的调控

2.1 BMP2信号通路在成骨分化中的作用

2.2经典Wnt信号通路在成骨分化中的作用

2.3 BMP-2信号通路和经典Wnt信号通路的相互调节

参考文献

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