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致谢
缩写词表
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 可再生能源的研究进展
1.2.1 可再生能源简介及分类
1.2.2 可再生能源利用现状
1.2.3 生物法合成生物燃料的研究及应用现状
1.3 酿酒酵母生产生物燃料和多种化学品的研究进展
1.3.1 萜类化合物简介
1.3.2 萜类合成途径简介
1.3.3 新型航空燃料 epi?isozizaene的生物合成
1.3.4 维生素 D类化合物的简介
1.3.5 活性 VD3的生理功能和用途
1.3.6 25-羟基维生素 D3的生产方法
1.3.7 S-腺苷甲硫氨酸的生物合成
1.4 酿酒酵母代谢工程改造的新方法
1.4.1 CRISPR-Cas 系统
1.4.2 Gibson 重组
1.5 本论文的研究设想
第二章 酿酒酵母工程菌生物合成航空燃料 EIZ的研究
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 仪器设备
2.2.2 主要材料
2.2.3 生化试剂与培养基
2.2.4 菌株与质粒
2.3 实验方法
2.3.1 分子生物学操作
2.3.2 酿酒酵母化学转化高效感受态的制备及转化
2.3.3 大肠杆菌热激感受态的制备
2.3.4 大肠杆菌热激感受态的转化
2.3.5 CRISPR-Cas9 系统在酿酒酵母基因组中插入或敲除基因
2.3.6 发酵生产航空燃料 EIZ
2.3.7 发酵参数的检测方法
2.4 结果与讨论
2.4.1 EIZS 表达质粒的构建与利用 HXT1 启动子调节 ERG9的表达
2.4.2 MVA通路基因过表达对 EIZ合成的影响
2.4.3 10 L发酵罐中 S. cerevisiae HD-EIZ004 发酵合成 EIZ
2.5 本章小结
第三章 酿酒酵母代谢工程合成7-脱氢胆固醇的研究
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 仪器设备
3.2.2 主要试剂与培养基
3.2.3 菌种与质粒
3.3 实验方法
3.3.1 gRNA的设计与质粒构建
3.3.2 酿酒酵母电转化高效感受态的制备及转化
3.3.3 菌株验证
3.3.4 发酵生产 7-脱氢胆固醇
3.3.5 10 L发酵罐中 7-脱氢胆固醇的发酵合成方法
3.3.6 发酵参数的检测方法
3.4 结果与讨论
3.4.1 过表达 MVA 通路基因同时敲除 ERG5和 ERG6对 7-DHC 前体供应的影响
3.4.2 不同启动子表达甾醇-C24-还原酶对 7-DHC 生物合成的影响
3.4.3 不同拷贝数对 7-DHC 生物合成的影响
3.4.4 传代驯化对菌株生长的影响
3.4.5 10 L发酵罐中 S. cerevisiae HD-DHC013 利用无机盐培养基发酵合成 7-DHC
4.5 本章小结
第四章 从有机污染土壤中筛选25羟基维生素D3产生菌的研究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 仪器设备
4.2.2 实验材料
4.2.3 主要试剂与培养基
4.3 实验方法
4.3.1 羟基化 VD3 菌株的分离与纯化
4.3.2 羟基化 VD3 菌株的筛选及产物鉴定
4.3.3 菌种鉴定
4.3.4 最适转化条件的单因素优化实验
4.3.5 5 L发酵罐的放大转化
4.4 结果与讨论
4.4.1 羟基化 VD3 的菌株的筛选
4.4.2 羟基化 VD3 的菌株的鉴定
4.4.3 全细胞催化及产物纯化鉴定
4.4.4 转化条件的优化
4.4.5 5 L发酵罐放大转化体系
4.5 本章小结
第五章 7-脱氢胆固醇羟基化合成25-羟基-7脱氢胆固醇的探索性研究
5.1 引言
5.2 材料方法
5.2.1 仪器设备
5.2.2 主要试剂与培养基
5.2.3 菌株
5.2.4 培养条件
5.3 实验方法
5.3.1 链霉菌 748 在 FM 培养基中生长曲线的测定
5.3.2 7-脱氢胆固醇溶液的配制
5.3.3 链霉菌 748 全细胞催化 7-脱氢胆固醇
5.3.4 7-脱氢胆固醇转化产物的检测
5.3.5 转化体系的放大及转化产物的分离纯化
5.3.6 分离纯化的转化产物的鉴定
5.4 结果与讨论
5.4.1 链霉菌 748 在 FM 培养基中生长曲线的测定
5.4.2 链霉菌 748 全细胞催化 7-DHC 的产物初步分析
5.4.3 链霉菌 748 全细胞催化 7-脱氢胆固醇产物分离纯化及质谱分析
5.5 本章小结
第六章 酿酒酵母合成SAM过程中杂质分子控制技术的研究
6.1 引言
6.2 实验材料
6.2.1 仪器设备
6.2.2 主要材料
6.2.3 生化试剂与培养基
6.2.4 菌株与质粒
6.3 实验方法
6.3.1 酵母基因组提取
6.3.2 PCR 产物纯化与 DNA胶回收
6.3.3 质粒提取
6.3.4 大肠杆菌热激感受态的制备
6.3.5 大肠杆菌热激感受态的转化
6.3.6 转化子的验证
6.3.7 SAM脱羧酶的诱导表达
6.3.8 SDS-PAGE电泳
6.3.9 SAM脱羧酶反应
6.3.10 dC-SAM的制备、浓缩与干燥
6.3.11 dC-SAM的分析与鉴定
6.3.12 dC-SAM用于工厂 SAM产品的质量监控
6.4 结果与讨论
6.4.1 SPE2表达质粒构建
6.4.2 SAM脱羧酶的诱导表达
6.4.3 酶法制备 dC-SAM
6.4.4 制备液相纯化 dC-SAM、纯度及质谱分析
6.4.5 纯化的 dC-SAM 用于工厂 50吨发酵罐生产 SAM产品的质量监控
6.5 本章小结
第七章 结论与展望
7.1 结论
7.2 创新点
7.3 展望
参考文献
作者简历
浙江大学;
