花椒精油的提取工艺、化学成分分析与抗菌活性研究

摘要

本论文主要研究花椒精油的萃取工艺、化学成分分析和抗菌活性。通过单因素试验和响应面设计分析试验确定最佳萃取工艺条件;并采用GC-MS分析法来确定花椒精油的主要化学成分。利用体内和体外抗菌试验研究花椒精油对大肠杆菌的抑制作用，并研究体外抑菌机理，以及从分子水平研究花椒精油对大肠杆菌致肠道感染的抑制作用。主要的研究内容和结果如下:
　　1、花椒精油的提取。利用超临界二氧化碳萃取法萃取花椒精油，通过单因素试验和响应面分析设计法得到优化的提取工艺条件。条件为:萃取压力为26.3MPa、萃取时间为2.53h、萃取温度为50℃、萃取CO2流量为21L/h、萃取花椒粉目数为60目，此时花椒精油得率为11.15％。
　　2、花椒精油的主要化学成分分析。采用气-质联用仪GC-MS分析法对花椒精油的主要化学成分进行分析，结果表明花椒精油主要含有两大类化合物，分别是烃类含氧有机化合物和萜烯类化合物。其中烯烃类化合物24种，占比41.372％;醇类化合物12种，占比为18.923％;酯类化合物13种，占比为35.870％;酮类化合物5种，占比为2.330％;醛类化合物2种，占比为0.157％;酸类化合物3种，占比为1.348％。其中含量较高的5种化合物分别是:2，6，9，11-十二烯-1-羧酸甲酯，占比为12.428％;乙酸-4-萜烯酯，占比为11.249％;氧化石竹烯，占比为8.768％;D-柠檬烯，占比为7.902％;桉叶油醇，占比为5.935％。
　　3、花椒精油的体外抗大肠杆菌活性及机理研究。通过体外抗菌实验研究花椒精油对大肠杆菌的抑制作用。采用二倍稀释法，得到花椒精油抑制大肠杆菌的最低抑菌浓度为24mg.mL-1，且在细菌生长的延至期和对数初期加入花椒精油后，细菌生长明显受到抑制;采用滤纸片法，得到花椒精油的抑菌圈直径约为20mm±1.0mm，结果表明花椒精油具有较强的抑制大肠杆菌作用。通过革兰氏染色法，扫描电镜的观察以及细菌细胞溶出物的测定，初步确定花椒精油的抑菌机理是破坏大肠杆菌细胞的完整结构，导致细胞膜破裂，细胞内容物渗出，最终致使大肠杆菌死亡。
　　4、花椒精油体内抗大肠杆菌致肠道感染活性及分子机理研究。通过腹腔注射大肠杆菌建立小鼠腹泻模型，研究花椒精油体内抗大肠杆菌致肠道感染活性。实验小鼠分为6组:正常对照组、模型对照组、阳性对照组（黄连素）、花椒精油高剂量组、花椒精油中剂量组、花椒精油低剂量组，连续给药6天。通过小鼠症状评判、腹泻率计算、以及小鼠体重、摄食和摄水量分析，研究结果表明花椒精油对小鼠大肠杆菌感染腹泻有良好的改善效果，呈剂量依赖性。对小鼠小肠组织病理组织学切片观察，结果表明模型对照组小鼠小肠组织明显受到损伤，小肠绒毛组织结构不完整、萎缩断裂、脱落明显、肠腺组织结构模糊，粘膜下层明显水肿，浸润大量炎性细胞;花椒精油高剂量组对上述小肠病理组织学改变具有明显的改善作用，小肠绒毛排列整齐有序，很少肿胀脱落，基本没有炎性细胞浸润，小肠上皮组织较完整。结果表明花椒精油对大肠杆菌感染致小鼠腹泻有明显改善作用，对损伤的肠道组织具有明显的保护作用。
　　在大肠杆菌致小鼠腹泻的发病过程中，多种炎性细胞因子发挥了重要的作用。本文研究了小鼠小肠组织Toll样受体2(TLR-2)、Toll样受体4(TLR-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)5种炎性细胞因子的基因表达，以及花椒精油的干预作用。结果表明，大肠杆菌致肠道感染小鼠的小肠组织中TLR-2、TLR-4、TNF-α、 IL-6、IL-8基因表达量明显升高，经花椒精油干预后，小肠组织中TLR-2、TLR-4、TNF-α、IL-6、IL-8基因表达量均明显降低，说明花椒精油抑制大肠杆菌感染致肠道功能紊乱的机理可能与调节相关炎性细胞因子表达有关。
　　综上所述，采用超临界二氧化碳萃取法可以得到较优的花椒精油提取工艺，并对花椒精油的主要化学成分进行了分析。花椒精油对大肠杆菌有明显的体内体外抑制作用，对大肠杆菌感染致小鼠腹泻和肠道组织损伤具有明显的改善和保护作用。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 花椒主要化学成分

1．2．1 挥发油

1．2．2 生物碱

1．2．3 酰胺类

1．2．4 木脂素

1．2．5 香豆素

1．2．6 其他成分

1．3 花椒精油的提取方法的研究

1．3．1 水蒸汽蒸馏法

1．3．2 溶剂浸提法

1．3．3 同时蒸馏萃取法

1．3．4 超临界CO2萃取法

1．4 花椒精油的生物活性研究

1．4．1 花椒精油的杀虫作用

1．4．2 花椒精油的抗炎镇痛作用

1．4．3 花椒精油的抗肿瘤作用

1．4．4 花椒精油的抗氧化作用

1．4．5 抑制血小板凝集的作用

1．5 花椒精油抗菌作用研究进展

1．5．1 大肠杆菌简介

1．5．2 抗菌作用

1．6 研究意义及内容

1．6．1 研究的意义

1．6．2 主要研究内容

第二章 花椒精油的提取工艺研究

2．1 实验材料

2．2 实验试剂、仪器设备

2．2．1 化学试剂

2．2．2 仪器设备

2．3 试验方法

2．3．1 样品前处理

2．3．2 花椒精油得率的计算

2．3．3 单因素试验

2．3．4 响应面试验

2．3．5 验证试验

2．4 结果分析

2．4．1 单因素试验结果

2．4．2 响应面试验结果

2．4．3 小结

第三章 花椒精油化学成分分析

3．1 实验材料、试剂与仪器设备

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验仪器设备

3．2 试验方法

3．2．1 花椒精油样品前处理

3．2．2 色谱条件

3．2．3 质谱条件

3．2．4 图谱分析

3．3 实验结果与分析

3．3．1 花椒精油主要化学成分分析及相对含量

3．4 小结

第四章 花椒精油体外抗大肠杆菌活性研究

4．1 实验材料

4．1．1 菌种

4．1．2 培养基

4．1．3 药品与试剂

4．1．4 仪器设备

4．2 试验方法

4．2．1 最小抑菌浓度MIC的测定

4．2．2 抑菌活性的测定

4．2．3 生长曲线的测定

4．2．4 普通显微镜的观察

4．2．5 场发射扫描电子显微镜的观察(SEM)

4．2．6 细菌细胞溶出物的测定

4．3 结果分析

4．3．1 最小抑菌浓度MIC的测定结果

4．3．2 抑菌活性的测定结果

4．3．3 生长曲线的测定结果

4．3．4 普通显微镜观察的实验结果

4．3．5 场发射扫描电子显微镜(SEM)观察的实验结果

4．3．6 细菌细胞溶出物的测定结果

4．4 小结

第五章 花椒精油体内抗大肠杆菌致肠道功能紊乱活性研究

5．1 实验材料

5．1．1 菌种

5．1．2 实验动物

5．1．3 药品

5．1．4 试剂

5．1．5 仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 动物腹泻模型的建立

5．2．2 实验分组

5．2．3 临床症状评价

5．2．4 腹泻率计算

5．2．5 体重检测

5．2．6 摄水量、摄食量检测

5．2．7 病理组织学观察

5．3 统计学处理

5．4 实验结果

5．4．1 腹泻临床症状观察结果

5．4．2 体重检测结果

5．4．3 摄食检测结果

5．4．4 饮水量检测结果

5．4．5 腹泻率计算结果

5．4．6 病理组织学观察结果

5．5 小结与讨论

第六章 花椒精油抗大肠杆菌致小鼠肠道功能紊乱分子机理研究

6．1 材料、试剂与仪器

6．1．1 试验材料

6．1．2 试验试剂

6．1．3 试验仪器

6．1．4 引物设计

6．2 试验方法

6．2．1 RT-PCR法测定相关基因的表达

6．2．2 统计方法

6．3 结果与分析

6．3．1 Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)

6．3．2 肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)基因

6．3．3 白细胞介素(interleukin，IL)

6．4 小结与讨论

第七章 结论与展望

7．1 主要结论

7．2 展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文