解淀粉芽孢杆菌WK1产脂肽产量评价新方法及其培养条件优化

摘要

芽孢杆菌代谢产生的脂肽类物质具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性，但芽孢杆菌脂肽产量普遍较低，探索高产量的培养条件是开发利用的重点，而快速的产量评价方法则可大大提高条件探索的效率。本论文在前人成功筛选出一株对山核桃干腐病病原菌葡萄座腔菌B.dothidea有明显抑制效果的芽孢杆菌WK1的基础上，开展了解淀粉芽孢杆菌WK1最佳发酵时间、评价其产量的新方法探索，应用液相电喷雾质谱法对主要代谢产物成分进行鉴定，应用HPLC评价不同培养基、不同初始pH以及不同接种量对脂肽抗生素产量影响，以其获得最佳发酵条件。获得以下初步结果：　　最好的发酵时间的探索。芽孢杆菌WK1作为芽孢杆菌属，对山核桃干腐病病原菌葡萄座腔菌B.dothidea有明显的抑制效果。通过48、60、72小时等3个不同时间的摇瓶发酵得到抗生素代谢产物，制作含有抗菌物质的固体培养基，将葡萄座腔菌B.dothidea的病原菌的单细胞接种到所有含有抗生素的培养基中均无法生长，而以病原菌饼接种到含有抗生素的培养基中，则可以观察到抑制率抑制效果的差别，最好的发酵时间为72h。　　一种快速评价芽孢杆菌脂肽产量以及底物碳利用效率的新方法。以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WK1为试验菌株，设计不同初始 pH（5、6、7）培养，生产不同产量（浓度）的抗菌脂肽物质，通过测定发酵液酸沉降前后总有机碳的差值、推算脂肽类物质粗提物的产量，以传统的重量法为对照。不同处理的重量法与差减法脂肽产量差异规律相同，均为 pH6＞pH7＞pH5，两者的相关体系数为 0. 5632 （n=9），但相同初始 pH条件下差减法所得的数值均高于重量法。pH5条件下微生物产脂肽效率和二氧化碳排放量均最低，初始 pH6与pH7条件下单位培养基有机碳的二氧化碳排放量(700 C mg?Kg-1)相同，但pH6条件下产脂肽产量（1228 mg?L-1培养基）和产脂肽效率（234 mg?Kg-1 OC）最高。结论，差减法是评价脂肽产量的简单快速而有效的方法。　　WK1菌株生产抗生素的条件优化。通过不同培养基种类（Landy培养基 和NA培养基）、接种量（3%和5%）、初始pH值（5、6和7）对WK1菌株进行发酵的过程中发现，对于脂肽抗生素，NA培养基脂肽抗生素产量比Landy培养基高、5%接种量产量比3%接种量高、pH6产量高于pH7高于pH5。对于聚酮类物质，Landy培养基产量比NA培养基高、3%接种量产量比5%接种量高、pH6产量高于pH7高于pH5。所有培养基条件下，脂肽抗生素的产量都明显高于聚酮类物质，从脂肽物质产量角度考虑应该选择NA培养基，由于前期重量法初步评价培养基对脂肽类粗提物影响时发现，Landy培养基的产量明显高于NA培养基，所以没有对NA培养基的接种量和初始pH进行深入实验，需要继续探索。WK1产聚酮类物质优化条件是Landy培养基、3%接种量和初始pH6（装瓶量300mL情况下）。

目录

声明

1 文献综述

1.1芽孢杆菌产抗菌类物质研究概况

1.1.1芽孢杆菌在植物生防中应用进展

1.1.2 脂肽抗生素种类

1.2脂肽抗生素对病菌的抑制作用研究

1.2.1 脂肽抗生素对真菌性植物病害防治的研究现状

1.2.2 芽孢杆菌抗菌脂肽的抑菌机理研究

1.3芽孢杆菌产脂肽物质发酵条件优化研究

1.3.1 培养基对抗菌脂肽物质发酵产量的影响

1.3.2 初始pH对抗菌脂肽物质发酵产量的影响

1.3.3 温度对抗菌脂肽物质发酵产量的影响

1.3.4 初始接种量对抗菌脂肽物质发酵产量的影响

1.3.5 其他条件对抗菌脂肽物质发酵产量的影响

2 立题依据与研究内容

2.1立题依据

2.2研究内容

2.2.1 解淀粉芽孢杆菌WK1产脂肽产量的最佳发酵时间确定

2.2.2检测芽孢杆菌脂肽物质产量的新方法探索

2.2.3解淀粉芽孢杆菌WK1发酵条件优化

2.3技术路线

3 解淀粉芽孢杆菌WK1产脂肽产量的最佳发酵时间确定

3.1 材料与方法

3.1.1供试菌株

3.1.2培养基配方

3.1.3种子培养液

3.1.4 试验设计

3.1.5 抑制效果观察

3.2 结果与讨论

3.2.1 最高产量的发酵时间确定

3.2.2结论

4检测芽孢杆菌脂肽物质产量的新方法探索

4.1 材料与方法

4.1.1供试菌株

4.1.2 培养基配方

4.1.3种子培养液

4.1.4试验设计

4.1.5脂肽类物质产量测定

4.1.6数据统计方法

4.2 结果与分析

4.2.1不同初始pH随发酵时间的动态变化

4.2.2重量法与差减法结果比较

4.2.3 培养基底物碳的利用效率评价

4.3结论

5 解淀粉芽孢杆菌WK1发酵条件优化

5.1 材料与方法

5.1.1供试菌株

5.1.2 培养基配方

5.1.3种子培养液

5.1.4试验设计

5.1.5抗菌类物质双水相萃取

5.1.6脂肽物质的分子结构鉴定

5.1.7 脂肽物质的含量分析

5.1.8数据统计方法

5.2 结果与分析

5.2.1脂肽物质的分子结构鉴定

5.2.2 培养基对抗菌类物质产量的影响

5.2.3 初始pH对抗菌类物质产量的影响

5.2.4 接种量对抗菌类物质产量的影响

5.3 结论

6 结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

个人简介

致谢