典型全氟类化合物的生态毒性效应研究

摘要

全氟化合物（Perfluoroalkyl Substances,PFASs）的全球性污染，带来的生态系统稳定维护和人类健康安全保障问题使其成为生态环境领域的持续的研究热点；评价其健康风险，研究其毒性效应以及探索能够有效监测、管控、减除PFASs污染的方法等研究内容，已经成为研究焦点。　　本研究通过选取典型的全氟化合物，在细胞水平，蛋白质水平及基因水平，利用生态毒理学、细胞生物学、生物化学与分子生物学等学科交叉手段，进行全氟化合物毒性效应的综合分析研究；并模拟生理条件下，开展全氟化合物毒性作用分子机制的探索研究。主要内容为以下七个部分：　　1、紫外分光光度法测定了全氟辛酸（Pentadecafluorooctanoic Acid,PFOA），全氟辛基磺酸钾盐（Perfluorooctane Sulfonate-k,PFOS-k），全氟-1-辛烷磺酰氟（Perfluoro-1-Octanesulfonyl Fluoride,POSF）三种典型全氟类化合物与生物活性大分子人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)/小牛胸腺DNA(CalfThymus DNA,CtDNA)的结合常数，表明了PFASs与HSA/CtDNA之间存在结合强度适中的结合作用。　　2、荧光光谱结果获知，PFOA与HSA之间生成静态复合物，造成HSA发生荧光猝灭效应；热力学参数计算表明，HSA与PFOA间的相互作用力以疏水作用力为主；同步荧光光谱表明，PFOA可以引起HSA的构象发生改变；荧光偏振光谱数据证明PFOA与HSA两者间确实存在强度适中的结合作用，生成非共价结合物。　　3、运用毛细管电泳技术，采用淌度法及简化的Humme l-Dreyer法、区段-区段动力学法等方法研究了PFOA/PFOS-k/POSF与HSA的相互作用。应用Scatchard方程、Klotz方程、非线性拟合方程、结合速率相比法测定了PFOA/PFOS-k/POSF与HSA相互作用体系的结合常数K和结合位点n。不同的实验方法及理论方程都能够反映体系的作用效果：结合常数K数量级在103-104之间。结合位点数n平均皆为1，结合作用只有单一类型的结合位点。有效构建PFOA/PFOS-k/POSF与HSA结合作用分析模型。　　4、通过计算机模拟技术对PFOA/PFOS-k/POSF-HSA体系进行分子对接。分子模拟从理论上揭示PFOA/PFOS-k/POSF在HSA上的结合部位及体系内作用力类型，从分子水平上直观清楚的呈现体系内相互作用机制。结果与光谱学和毛细管电泳实验结果一致：体系内存在结合强度适中的相互作用，作用力主要有疏水作用力承担。　　5、利用PFOA/PFOS-k/POSF对SMMC-7721肝癌细胞作用后进行形态学观察可发现，PFASs对细胞具有显著毒性效应。应用MTT比色分析法对PFASs的毒性作用进行定量分析，结果表明作用具有一定的剂量效应特征。细胞经PFOA处理后，通过流式细胞术检验，实验表明随PFOA浓度增高，凋亡细胞数目相应增加，结果与形态学及MTT法实验结果一致：PFASs在细胞水平上，具有显著的毒性作用，且毒性作用具有一定的剂量效应特点。　　6、利用蛋白免疫印迹技术（Western blot），研究全氟化合物在细胞活性蛋白水平上的毒性表现。SMMC-7721细胞经不同浓度的PFOA/POSF处理后，细胞内的表达量出现明显的异常：Bax蛋白表达量显著上升，同时Bcl-2蛋白表达量明显下降，表明全氟化合物可能干扰细胞的正常蛋白表达功能。　　7、基因水平上，对全氟化合物的毒性表现进行深入探究。S MMC-7721细胞经PFOA处理后，利用实时荧光定量法发现，Bax mRNA与Bcl-2 mRNA表达水平出现明显差异：Bax mRNA表达上调，Bcl-2 mRNA表达下调。通过细胞内两种关键的基因Bcl-2、Bax的表达水平的变化情况，反映出全氟类化合物可能具有直接影响细胞的正常的基因表达的能力。

目录

声明

1文献综述

1.1 全氟化合物生态毒理效应的研究进展

1.2 全氟化合物生态毒理效应的研究方法

1.3 本研究的意义和创新

2全氟类化合物与生物大分子相互作用的紫外分光光度法研究

2.1引言

2.2 实验材料与条件

2.3结果与讨论

2.4 结论

3全氟类化合物与生物大分子相互作用的荧光分光光度法研究

3.1引言

3.2 材料与条件

3.3 实验结果与讨论

3.4 结论

4全氟类化合物与生物大分子相互作用的毛细管电泳法研究

4.1引言

4.2 材料与条件

4.3 实验结果与讨论

4.4结论

5 分子模拟对接技术研究全氟类化合物与生物大分子的相互作用

5.1引言

5.2 实验材料与条件

5.3实验方法

5.4 实验结果与讨论

5.5 结论

6全氟类化合物对细胞毒性作用的探究

6.1引言

6.2 实验材料与条件

6.3 结果与讨论

6.4 结论

7 蛋白免疫印迹法探究全氟类化合物蛋白水平生理毒性的表现

7.1引言

7.2 实验材料与条件

7.3 结果与讨论

7.4 结论

8实时荧光定量法探究全氟类化合物基因水平生理毒性的表现

8.1引言

8.2 实验材料与条件

8.3结果与讨论

8.4结论

9 结论与展望

9.1结论

9.2展望

参考文献

附录

个人简介

硕士期间发表/投稿论文

致谢