三叶青中血管靶向活性成分的定向筛选及其抗肿瘤血管生成作用研究

摘要

恶性肿瘤呈浸润性生长，且会通过血管进行转移，这大大增加了治疗难度。目前，以血管生成相关因子为治疗靶点来控制肿瘤已经成为有效的肿瘤辅助治疗手段之一。血管内皮生长因子（VEGF）参与血管形成过程，影响肿瘤的增殖、扩散以及转移。三叶青是很有效果的民间抗癌中药材，并且已经在临床治疗中使用，大量文献也表明三叶青可以控制肿瘤细胞的生长，但是其是否与VEGF作用影响血管的生成还没有任何报道。　　本试验通过偶联VEGF活性蛋白的亲和柱筛选三叶青中能与VEGF特异性结合的活性成分，然后通过高效液相色谱法、液质联用法鉴定三叶青中与VEGF直接结合的具体成分。运用MTT法以及结晶紫法检测三叶青及其活性成分原花青素B1、儿茶素处理后人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的细胞增殖情况；通过细胞迁移和侵入试验检测三叶青及原花青素B1、儿茶素对HUVEC细胞的迁移能力、侵袭能力的影响；运用管道生成试验检测三叶青及原花青素B1、儿茶素处理后对HUVEC细胞管状形成能力的影响；进行蛋白质免疫印记试验（Western blot）检测经过三叶青及原花青素B1、儿茶素处理后HUVEC细胞VEGF、（P）AKT、（P）ERK1/2、Ras蛋白表达水平的变化，检测其对MAPK/ERK、PI3K/AKT通路的影响；通过免疫组化试验检测三叶青给药后的荷瘤小鼠肿瘤组织血管标记物CD34、CD31以及生长因子VEGF表达量的变化。得到的主要结果如下：　　1.三叶青中与VEGF特异性结合的物质为原花青素B1以及儿茶素，且原花青素B1能够洗脱，儿茶素结合紧密几乎没有洗脱；　　2.三叶青醇提物及原花青素B1对HUVEC细胞没有明显的抑制增殖的作用，儿茶素对HUVEC细胞有明显的抑制作用且呈剂量依赖性；　　3.三叶青醇提物及原花青素B1、儿茶素对细胞的迁移能力及侵袭能力有着显著的抑制作用；　　4.三叶青（30μg/mL）及原花青素B1（30μmol/L）、儿茶素（30μmol/L）对HUVEC细胞的管状形成能力有极为明显的抑制作用；　　5.三叶青及原花青素B1、儿茶素能够通过抑制VEGF、（P）AKT、（P）ERK1/2蛋白的表达和磷酸化过程来抑制MAPK/ERK、PI3K/AKT通路，从而抑制肿瘤血管的生成。　　6.三叶青对肿瘤组织的血管生成有着显著的抑制作用，CD34、CD31阳性细胞随给药剂量的增加而减小，VEGF表达水平随剂量增加而降低。　　试验表明，VEGF亲和柱可以较好的筛选出三叶青中抗肿瘤血管生成靶向的活性成分：原花青素B1和儿茶素，这些活性因子能通过抑制VEGF的活性来抑制细胞的迁移、侵袭以及管状形成能力，抑制MAPK/ERK、PI3K/AKT通路的表达，从而抑制肿瘤血管的生成。研究揭示了三叶青抗肿瘤的作用机制，并为筛选具有抗血管生成功能的天然抗肿瘤药物提供了一种较简便的方法。

目录

声明

1 文献综述

1.1 血管新生

1.2 肿瘤的血管生成与转移

1.3 抗肿瘤靶点VEGF

1.4 当前针对血管生成的抗肿瘤药物

1.5 三叶青在肿瘤转移方面的研究进展

1.6 问题与展望

2 VEGF亲和柱对三叶青醇提物中VEGF亲和柱因子的筛选

2.1 试验试剂与仪器

2.2 试剂配制

2.3 样品提取

2.4 样品筛选与检测

2.5 试验结果

2.6 小结与讨论

3 三叶青提取物及其效应物质对人脐静脉内皮细胞的作用

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 试验结果

3.4 小结与讨论

4 三叶青提取物对4T1荷瘤小鼠血管新生的作用

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 试验结果

4.4 小结与讨论

5 结论与展望

参考文献

个人简介

在校期间发表论文情况

致谢