耐砷与砷敏感野生稻鉴定及其砷耐性差异的蛋白质组学研究

摘要

水稻砷污染严重影响水稻的产量、品质及人类健康。提高水稻对砷的耐受性,减少对砷的吸收是解决水稻砷污染的有效途径。研究发现,不同栽培稻对砷的吸收、转运和耐性等存在显著基因型差异,但野生稻对砷的耐受性到底如何及其砷耐性差异机理尚不清楚。野生稻富含优异基因资源,是水稻抗逆育种及理论研究的宝贵材料。本实验首次以12种基因型野生稻为研究材料,从中鉴定出对砷高耐受性且低积累以及砷敏感的野生稻。在此基础上,采用定量蛋白质组技术(iTRAQ)研究它们在砷胁迫下显著差异表达的蛋白质,初步揭示其砷耐性差异的内在机理。主要结论如下:　　(1)综合考虑各供试基因型在25μM亚砷酸盐处理下的表型、根伸长量、对砷的吸收与转移能力等,鉴定出对砷高耐受性且低积累的基因型92606及砷敏感基因型103420。与103420相比,在砷胁迫条件下92606幼苗叶片中 SOD、CAT和APX等抗氧化酶活性显著增加,表明耐砷基因型92606可通过增加植株体内抗氧化酶的活性来缓解砷危害引起的氧化胁迫。　　(2)采用iTRAQ技术从92606和103420砷处理下的根部组织中共鉴定到3272个蛋白质。在砷处理6h时,从92606中共鉴定到172个显著差异表达的蛋白质(其中82个上调和90个下调),而砷敏感基因型103420中共鉴定出107个上调蛋白和112个下调蛋白。GO富集分析和KEGG代谢途径分析结果表明,这些差异表达蛋白主要与代谢过程、防御反应、氧化应激、蛋白质合成、光合作用、糖酵解代谢和三羧酸(TCA)循环以及氨基酸合成等有关。尤其是,耐砷水稻92606根中氧化磷酸化,半胱氨酸、甘氨酸等氨基酸代谢,脂肪酸生物合成等相关蛋白被诱导表达。　　(3)上述鉴定的大部分差异表达蛋白与砷酸盐胁迫应答表达基因不同,表明水稻响应As(Ⅴ)和As(Ⅲ)胁迫的机制不同。　　(4)经检索水稻插入突变体库 OryGenesDB发现,两个基因型中多数显著差异表达蛋白(>3倍)均有插入突变体信息,其中有些基因突变体的表型为种子结实率低、植株矮化或半矮化和叶片黄化等。　　本实验研究结果不仅可为水稻抗逆育种或品种改良提供重要的基因资源和育种种质,而且为深入揭示水稻砷耐性差异的分子机理奠定了坚实基础。

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1 文献综述

1.1 水稻砷污染研究概述

1.1.1 砷对植物生长的影响

1.1.2不同形态砷对植物毒理的机理

1.1.3 水稻对As的吸收、转运和耐性

1.2 水稻蛋白质组学研究进展

1.2.1 蛋白质组学概述

1.2.2 蛋白质组学研究技术

1.2.3 水稻组织器官发育的蛋白质组学研究

1.2.4 水稻亚细胞水平结构的蛋白质组学研究

1.2.5 逆境胁迫下水稻蛋白质组学研究

1.3 本研究目的与意义

2 耐砷、砷敏野生稻鉴定及其响应砷胁迫的生理特性研究

2.1实验仪器与试剂

2.2 实验设计与材料处理

2.3 实验方法

2.3.1 砷含量测定和数据分析

2.3.2 抗氧化酶活性测定

2.4 结果与分析

2.4.1 耐砷、砷敏基因型野生稻的鉴定

2.4.2耐砷、砷敏基因型水稻叶片抗氧化酶活性显著性分析

2.4.3讨论

3 耐砷、砷敏基因型水稻砷耐性差异的蛋白质组研究

3.1实验仪器与试剂

3.2实验材料的处理

3.3实验方法

3.3.1 水稻材料蛋白质提取

3.3.2 蛋白浓度测定（Modified Bradford法）

3.3.3 SDS-PAGE单向检测

3.3.4 胰酶酶解与肽段定量

3.3.5 肽段分级分离与Q Exactive 质谱鉴定

3.4 结果与分析

3.4.1蛋白质浓度测定

3.4.2 SDS-PAGE单项检测

3.4.3 iTRAQ蛋白定量结果分析

4 结果与讨论

参考文献

致谢