六味地黄汤对甲亢型肾阴虚大鼠肝线粒体蛋白质组影响的研究

摘要

目的：本实验通过蛋白质组学中双向电泳技术和质谱技术平台，应用图象分析系统，分离和分析正常对照组大鼠、甲亢型肾阴虚模型组大鼠、以及六味地黄汤治疗组大鼠肝线粒体蛋白质组表达量和/或质的变化信息，从能量代谢角度来研究肾阴虚证在肝线粒体蛋白质组学变化，了解肾阴虚证的发病机理，并从蛋白质组水平探讨六味地黄汤的作用机理。　　方法：18只Wistar雄性大鼠随机分成3组：正常对照组、甲亢型肾阴虚模型组以及六味地黄汤治疗组。正常对照组大鼠连续生理盐水灌胃21天；甲亢型肾阴虚模型组大鼠连续甲状腺片药液灌胃21天；六味地黄汤治疗组大鼠连续甲状腺素片药液灌胃21天，于第8天起用六味地黄汤治疗，共14天。动物处死后以差速离心法分离肝线粒体，并提取蛋白质。每组6个样品等量混合进行蛋白质双向电泳分离，经图象扫描、软件分析得到差异蛋白质。挖取感兴趣的蛋白质，经胶内酶解后，用质谱分析获得肽指纹图谱，所得结果与蛋白质组文库进行比对。　　结果：对照组3次凝胶的平均蛋白质点数为521个，模型组3次凝胶的平均蛋白质点数为587个，治疗组3次凝胶的平均蛋白质点数为612个。选取所有胶上相互匹配且分辨清楚的蛋白质点进行统计学分析，筛选出具有明显差异（Varition>2.0，P<0.05）的蛋白质点40个。经过胶内酶切后用基质辅助激光电离飞行时间质谱（MALDI TOF MS+MS/MS）进行检测：模型组与对照组比较，12个蛋白质点被确定，造模组大鼠肝线粒体中的氨甲酰磷酸合酶Ⅰ、转甲状腺素蛋白D链表达降低，短链-3-羟酰辅酶A脱氢酶、线粒体分裂蛋白1、谷胱甘肽硫转移酶Mu1、核有丝分裂器蛋白1、凋亡抑制蛋白3、热休克蛋白60、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶1β亚单位、核转录因子-kB2、BNIP1 protein、鸟氨酸转氨酶表达均比正常组升高；治疗组与模型组比较，11个蛋白质点被确定，经中药治疗后，Major urinary protein precursor、Peroxiredoxin-6、内质网蛋白29前体、大鼠转甲状腺素蛋白D链表达升高，78 kDa葡萄糖调节蛋白前体、谷胱甘肽硫转移酶Mu1、热休克蛋白60、肽基脯氨酰顺反式异构酶、核转录因子-kB2、H＋-转运ATP合酶、BNIP1 protein表达均降低。　　结论：肾阴虚动物能量代谢活跃，线粒体内物质分解氧化作用加强，柠檬酸循环和氧化磷酸化加速。肾阴虚动物存在以NF-kB过量表达活化为核心的免疫炎性细胞因子紊乱和凋亡抑制状态。这些发现提示肾阴虚证的发病机理和能量代谢亢进、炎性细胞因子紊乱、凋亡抑制状态有相关性。六味地黄汤滋阴补肾作用机理可能与下调线粒体内H＋-转运ATP合酶表达量从而减缓能量代谢、抑制NF-kB过量表达和活化来调节炎性细胞因子紊乱状态和凋亡抑制状态、上调PDX6表达对抗氧自由基损伤以及增强性激素分泌水平相关。

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前言

一、 材料与方法

（一）实验材料

1．实验动物

2．主要实验试剂

3．主要仪器设备

4．主要溶液配制

(二) 实验方法

1．中药制备