人甲状旁腺素（1-34）及血清白蛋白与人甲状旁腺素（1-34）融合蛋白的表达、纯化与鉴定

摘要

本研究为解决进一步进行PTH(1-34)口服或吸入等剂型的研究中的大量蛋白原料来源问题，运用基因工程技术，构建能够高效表达PTH(1-34)肽的重组大肠杆菌。实验选择了原核表达系统，通过纯化、酶切后，获得氨基端无其他氨基酸残基的重组PTH(1-34)肽，为今后开发PTH(1-34)肽的非注射途径给药研究奠定良好的物质基础。其次，为了延长PTH(1-34)在体内作用的半衰期，本研究中还设计了一种PTH(1-34)与人血清白蛋白(humanserumalbumin，HSA)的融合蛋白。作为血浆的重要成分之一，HSA是许多内源因子和外源药物的载体，正常情况下不易透过肾小球。在血浆中的半衰期长达2周，体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性，因而是一种理想的生物活性蛋白载体。通过基因工程技术改造了PTH(1-34)多肽分子，期望使其在不丧失受激活受体及刺激骨重建的功能的情况下，血浆中的半衰期能够得到显著地延长。这样HSA-PTH(1-34)融合蛋白就会降低给药频率和剂量却发挥出与PTH相似的药效作用。利用基因工程方法，构建能够高效表达HSA-PTH(1-34)融合蛋白的重组毕赤酵母工程菌，为进一步研究治疗骨质疏松的PTH(1-34)长效制剂奠定基础。 1.重组表达PTH(1-34)的大肠杆菌的构建及鉴定1.1重组pGEX-4T-PTH(1-34)表达质粒的构建根据人PTH的氨基酸序列，按大肠杆菌偏爱的密码子推断设计其PTH(1-34)的DNA序列，5'端添加BamHI酶切位点和肠激酶识别序列，3'端添加TAA终止密码子及EcoRI酶切位点，全序列合成后插入pUC19载体中。扩增后收获质粒，双酶切获取目的基因片段，插入经相应双内切酶酶切后的原核表达质粒pGEX-4T-1。连接产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞。DNA测序证实PTH(1-34)基因已经按预计的方案正确的插入原核表达载体pGEX-4T-1。1.2重组菌的诱导表达及目标蛋白的可溶性分析携有pGEX-4T-PTH(1-34)表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)鉴定正确后，在2×YT培养基中37℃培养3h，再经0.5mmol/LIPTG诱导7h后，收获菌体。SDS-PAGE可见GST-PTH(1-34)融合蛋白的分子量约为30kDa符合预计值。超声破菌后取上清及沉淀进行SDS-PAGE，发现可溶形式的目标蛋白占菌体总蛋白的40﹪左右。 1.3融合蛋白的纯化利用融合蛋白的GST标签，采用亲和层析法纯化融合蛋白GST-PTH(1-34)。超声破菌离心后取上清用GlutathioneSepharose4B琼脂糖珠进行亲和纯化，用竞争性洗脱液-还原型谷胱甘肽溶液洗脱。融合蛋白的纯度经过SDS-PAGE和光密度扫描分析，其纯度在92.5﹪。经过蛋白质定量，每升发酵液中的菌体可收获约0.5g的融合蛋白。 1.4融合蛋白的免疫印迹分析Westernblotting结果显示融合蛋白GST-PTH(1-34)能与羊抗PTH(1-34)多抗发生特异性结合。这表明PTH(1-34)基因正确插入表达载体中，未出现移码。 1.5融合蛋白的肠激酶酶切加工纯化后的融合蛋白GST-PTH(1-34)经过肠激酶20℃酶切过夜，酶切液用截留分子量为10000的超滤管高速离心收集PTH(1-34)。取酶切后的产物及超滤产物，进行SDS-PAGE分析。PTH(1-34)的产量约为每升发酵液中菌体可收获30mg,纯度达90﹪。 1.6PTH(1-34)的分子量及一级结构的鉴定PTH(1-34)肽经纳升级电喷雾质谱(nanoESI-MS)鉴定其分子量为4115.21，和理论值相差0.06﹪。对其进行ESI-MS/MS分析，测定胰蛋白酶酶切后四条肽段的序列和数据库查寻进行结构鉴定，验证了重组蛋白质PTH(1-34)一级结构与理论值一致，在表达纯化的过程中没有氨基酸的丢失和突变。 1.7PTH(1-34)的生物学活性鉴定采用经典的腺苷酸环化酶活性检测法确定重组PTH(1-34)的生物学活性。制作新鲜的兔肾皮细胞膜作为酶源，用CyclicAMPEIAKit来定量由于腺苷酸环化酶激活产生的cAMP的量。测活结果表明本研究重组的PTH(1-34)具有良好的腺苷酸环化酶激活能力，腺苷酸环化酶的表观活性为2104pmolcAMP/mgprotein·30min。 2.重组表达HSA-PTH(1-34)的毕赤酵母的构建鉴定 2.1pPIC9-HSA-PTH(1-34)重组质粒的构建及鉴定从人肝提取mRNA，经RT-PCR法获得血清白蛋白的全长基因，长度大约为1.8kb，TA连接将PCR产物克隆入pGEM-T载体中，测序验证基因序列与NCBI的GenBank数据库中的HSA的NM000477序列完全一致。设计含有柔性连接肽GlyGlyGlyGlySer的引物，从全合成PTH(1-34)基因中PCR法获得含有连接肽的PTH(1-34)基因。在原核宿主DH5α中成功地将人血清白蛋白基因的5'端通过柔性接头(GGGGS)与PTH(1-34)的3'端相连接，并克隆至pPIC9载体中。用PstI酶切鉴定重组质粒，证明已成功构建。 2.2毕赤酵母转化及转化子甲醇利用表型鉴定用氯化锂法制作毕赤酵母GS115感受态细胞，将用StuI线性化的pPIC9-HSA-PTH(1-34)转化至GS115中。转化后铺于不含组氨酸的RDB平板，30℃培养2天后长出约30个毕赤酵母转化子。点种至MM板和MD板进行甲醇利用表型筛选，其中Mut+型转化子约占总转化子的90﹪，Mut-型转化子约占总转化子的10﹪。 2.3毕赤酵母转化子PCR法鉴定以重组酵母的基因组为模板，用αfactor-up和AOX1-down为引物进行PCR检测，电泳在1900bp处有一明显条带。结果显示HSA-PTH(1-34)表达盒已经成功的整合至酵母基因组中。 2.4毕赤酵母转化子摇瓶诱导表达随机挑选的几个毕赤酵母转化子在摇瓶里30℃、以250r/min转速振荡培养，经0.5﹪甲醇诱导表达120h，电泳鉴定在70kDa处都出现了目标条带。选取4号转化子进行发酵培养，取诱导培养的24h、48h、72h、120h培养液样品，离心取上清进行SDS-PAGE分析。电泳鉴定发现随着诱导时间的延长，培养基中的分泌蛋白的量增多。运用免疫比浊法进行测定诱导96h发酵液中HSA-PTH(1-34)融合蛋白的浓度约为400mg/L。 2.5Westernblotting免疫印迹分析免疫印迹分析发现凝胶电泳中的70kDa条带既能与羊抗HSA抗血清，也能与羊抗PTH(1-34)多克隆抗体之间的发生特异性结合。免疫印迹的结果验证了的融合蛋白的HSA和PTH(1-34)两个结构域的存在，融合蛋白同时具有HSA和PTH(1-34)抗原性。 2.6HSA-PTH(1-34)融合蛋白的纯化取摇瓶中诱导表达96h的发酵培养基脱色，硫酸铵沉淀，脱盐处理后，得到粗纯化的融合蛋白HSA-PTH(1-34)。光密度扫描电泳结果显示其纯度达90﹪。 2.7HSA-PTH(1-34)融合蛋白的PMF鉴定将融合蛋白经过胰蛋白酶酶切后，用MALDI-TOF-MS质谱仪对酶解肽段做PMF分析。Mascot数据库检索结果表明融合蛋白中HSA结构域的存在。 2.8HSA-PTH(1-34)的生物学活性鉴定采用经典的腺苷酸环化酶刺激活性检测法确定HSA-PTH(1-34)的生物学活性。测活结果表明本研究重组的HSA-PTH(1-34)具有腺苷酸环化酶激活能力，腺苷酸环化酶的表观活性为1403pmolcAMP/mgprotein·30min。 综上所述：1.本实验采用基因工程的方法，在大肠杆菌中将PTH(1-34)肽与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达并采用肠激酶酶切加工的方法获得了氨基端无任何其他氨基酸残基的PTH(1-34)肽。不仅获得较高的表达量，提供了一种快速纯化PTH(1-34)肽的方法，而且避免了化学合成所造成的毒性以及小肽单独表达不利于检测、纯化的缺点。通过对重组PTH(1-34)的免疫学活性，生物学活性，分子量及一级结构的测定，证明已经成功构建可表达有活性的PTH(1-34)的高产工程菌。完全适合进一步扩大生产，为PTH(1-34)非注射途径给药研究打下良好基础。 实验中采用先进的纳升级电喷雾质谱技术(nanoESI-MS)和串联质谱技术(MS/MS)对重组多肽进行了分子量和全序列分析，具有准确、灵敏、快速的特点，为获得表达多肽更全面的质量控制信息提供了良好的技术基础。 2.经过westernblotting，腺苷酸环化酶刺激等实验验证了我们在毕赤酵母中成功的高表达出有生物学活性的HSA-PTH(1-34)融合蛋白，将会很大程度地延长PTH(1-34)在体内作用的半衰期，为进行骨质疏松症长效治疗制剂的研究做了铺垫。 该套表达系统的优点在于设计的HSA-PTH(1-34)融合基因适用于毕赤酵母菌中表达，构件的载体整合至酵母基因组中，十分稳定；而且醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，蛋白表达量高；同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后进行翻译后加工处理，在α-MF信号肽引导下外源蛋白分泌到细胞外，非常有利于重组蛋白的纯化。

目录

论文缩略词表

第一章 人甲状旁腺素（1-34）肽的融合表达、纯化与鉴定

前言

实验材料与试剂

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第二章 血清白蛋白与PTH（1-34）融合蛋白的表达，纯化及鉴定

前言

实验材料和试剂

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

综述 骨质疏松症治疗新药-甲状旁腺素的研究进展

学习期间发表论文情况

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