白念珠菌生物膜体内外模型建立及成膜基因表达水平的相关性研究

摘要

目的：　　白念珠菌是一种重要的条件性致病真菌。广谱抗生素和糖皮质激素的大量使用，以及在脏器移植、血液病治疗等领域越来越多免疫抑制的应用，内置医疗器材治疗以及艾滋病等免疫缺陷性疾病流行,使得深部真菌感染的发病率呈升高趋势。而临床上许多真菌感染与白念珠菌在组织、器官或医疗设备尤其是置入导管表面形成的生物膜有关。然而，白念珠菌生物膜形成后对唑类等常用抗真菌药物产生明显耐药性，导致临床抗真菌治疗的失败。能否及早从患者感染的白念菌株中鉴别出易于成膜的菌株，对临床尽早判断白念珠菌生物膜形成和指导临床用药均具有重要意义。本实验是从临床分离出的白念珠菌标本中筛选出易于成膜的菌株，并筛查形成白念珠菌生物膜的直接相关基因，通过小鼠白念珠菌生物膜体内实验,进一步验证该成膜相关基因对白念珠菌生物膜形成的预测作用。　　方法：　　1。将临床分离的白念珠菌（无体内留置导管等器材的患者获得的白念菌株）分离纯化后，建立体外生物膜模型，并在倒置显微镜下观察其形态结构，透射电镜下观察细胞内部结构有无变化；微量液基稀释法检测白念珠菌成膜前后的药敏的药敏变化，定性和定量PCR检测成膜相关基因的表达。　　2。根据荧光实时定量PCR法检测临床收集的白念珠菌ALS3基因的表达，依ALS3基因表达水平分为高、低ALS3基因表达组；采用小鼠腹腔埋置静脉导管和腹腔注射白念珠菌法建立白念珠菌生物膜动物模型；饲养两周后取出导管，倒置显微镜观察白色念珠菌成膜情况；透射电镜观察超微结构；导管冲洗干净后观察其生长情况；实时定量PCR法分别于导管取出后12h,24h,48h时检测ALS3基因表达情况。　　结果：　　1.生物膜形态结构：　　①倒置显微镜下可以明显观察到随着时间增加，菌丝不断增多，细胞沿菌丝聚集，形成完整的膜状结构；　　②透射电镜下的白念珠菌生物膜形成后，可以发现细胞膜增厚，且线粒体明显增多。　　2.药敏：生物膜形成后对唑类药物明显耐药（t值分别为3.71、3.68和3.5,均P＜0.05）；而对棘白菌素类药物虽然成膜前后的药敏结果差异显著（t值分别为3.79和3.76,均P＜0.05），但仍对其敏感。　　3.生物膜形成过程中相关基因检测：　　①形成生物膜的白念珠菌ALS3的表达明显高于未形成生物膜的菌株（t=3.645，P＜0.05），且其成膜后表达下降(t=2.491，P＜0.05）；　　②而EFG1，BGL2和 XOG1基因在原始菌株之间并无差异（t值分别为0.38、0.45和0.26，均P＞0.05），而均在形成生物膜后表达降低（t值分别为2.57、2.55和2.7，均P＜0.05）。　　4.ALS3基因与白念珠菌生物膜形成的相关性研究：ALS3基因的表达，在原始菌株之间存在差异，依据其表达情况，将白念菌株分为ALS3基因高表达组和低表达组：体外实验显示，高表达组菌株有11株（11/15）形成生物膜，低表达组仅有1株（1/10）形成生物膜，两组统计分析结果为χ2=9.64，P＜0.05，差异有统计学意义。　　5.ALS3基因与白念珠菌生物膜形成的相关性研究的小鼠体内实验：　　①ALS3基因高表达组2只小鼠死亡，8株（8/13）形成生物膜；低表达组仅1株（1/10）形成生物膜，两组经卡方检验后，χ2=4.02，P＜0.05，有统计学差异；　　②ALS3基因高表达组导管取出培养，9株（9/13）有菌落生长；低表达组5株（5/10）有菌落生长，统计后得出χ2=0.99， P＞0.05，两组之间无统计学差异。　　6.高表达组12、24和48h时ALS3基因相对表达量分别为13963±4135、8828±1536和4262±685，低表达组ALS3基因的相对表达量分别为1860±706、1574±663和1376±681，两组各时间的 ALS3基因表达比较差异均有统计学意义（t值分别为8.7、10.3和9.2，均P＜0.01）,两两对比有统计学差异。　　结论：　　白念珠菌ALS3基因在原始菌株之间的表达上的差异，高表达者易于形成生物膜，小鼠体内实验进一步证实了该结论。在形成白念珠菌生物膜高危人群中，通过检测ALS3基因的表达差异，对生物膜的形成，起到一定预测作用。

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声明

英文缩略词表

前言

实验一白念珠菌生物膜体外模型建立及成膜相关基因的表达

1 材料与方法

2 结果

3 小结

实验二白念珠菌生物膜动物模型建立及成膜相关基因ALS3的表达

1 材料与方法

2 结果

3 小结

讨论

结论

创新点

参考文献

综述：体外白念珠菌生物膜的联合用药的研究

2白色念珠菌生物膜的耐药机制

4 临床常见药物与其他药物联合应用

参考文献：

致谢

个人简历