基于流式细胞术的小鼠血小板聚集检测方法的评价及川芎嗪抗血小板聚集功能的研究

摘要

目的：　　动脉粥样硬化及其伴发的血栓性事件已经成为我国人口致残及死亡的首要原因。这类疾病的发病原因在于血栓的形成，而血栓形成的始动因素主要是由于血小板的激活与聚集，因此抗血小板治疗是治疗该类疾病的基石。近年来，与临床缺血事件发生可能有关的抗血小板药物的“抵抗”现象越来越引起人们的重视，活血化瘀类中药在治疗该类疾病中具有一定的优势。但中药的安全性和有效性以及抗血小板的作用机制仍需要动物实验来进一步明确。传统的血小板功能检测方法无法应用于小鼠。因此本研究拟建立流式细胞术（FCM）检测小鼠血小板聚集功能的平台，并利用该平台检测P2Y12受体拮抗剂、GPⅡb/Ⅲa受体阻断剂及中药提取物川芎嗪（TMPZ）对小鼠血小板聚集功能的影响。　　方法：　　实验一，选取35例健康志愿者和66例冠心病（CHD）患者，分别采用FCM和光学比浊法（LTA）检测其血小板聚集率，经Pearson相关性分析及Bland-Altman分析，评价FCM检测血小板聚集率与LTA检测结果的一致性。　　实验二，CD61-PE和CD61-FITC标记的C57BL/6J小鼠血小板（n=5）混合后加入二磷酸腺苷（ADP)诱导血小板聚集，通过分析同时标记两种荧光染料的细胞群占所有血小板的百分比来评估血小板的聚集功能；C57BL/6J小鼠（n=8）经FCM检测ADP诱导的血小板聚集率，诱聚时间分别为0、3、6、10、15和20min；16只雄性 C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水组[0.01 mL/(g·d)]和氯吡格雷组[11.26 mg/(kg·d)]灌胃7d，FCM检测小鼠血小板聚集率；16只雄性C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水组和替罗非班组（5μg/mL），体外给予药物干预，FCM检测其血小板聚集率；32只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组，取血后体外分别给予生理盐水和TMPZ低、中、高浓度（终浓度分别为0.5、1、2 mg/mL）进行干预，FCM检测其血小板聚集率。　　结果：　　实验一，健康人组LTA和FCM检测血小板聚集率结果分别为(57.74±15.39)％、(60.74±15.15)%，差异未见统计学意义（P＞0.05）；CHD组LTA和FCM检测血小板聚集率结果分别为(63.46±20.75)%、(66.47±23.23)%，差异未见统计学意义（P＞0.05）；健康人组、CHD组及所有研究对象LTA和FCM血小板聚集率结果经Pearson相关分析，结果呈正相关性（r值分别为0.871、0.812、0.827，P均<0.01）；健康人组、CHD组、所有研究对象经Bland-Altman评价，提示该两种检测方法具有较好的一致性。　　实验二，经ADP（20μmol/L）诱导激活后，含有双色荧光标记的细胞群即血小板聚集体明显增多（P<0.001）；经ADP（20μmol/L）诱导的小鼠血小板聚集率随诱聚时间增加而升高，在约10min时趋于平缓；FCM检测小鼠服用氯吡格雷后其血小板聚集率显著降低（P<0.001）；FCM检测替罗非班可显著降低小鼠血小板聚集率（P<0.01）；与生理盐水组相比，TMPZ低、中、高剂量均能降低小鼠血小板聚集率（P<0.01），并呈剂量依懒性。　　结论:　　FCM检测血小板聚集率与LTA具有较好的一致性，基于流式细胞术的小鼠血小板聚集功能检测方法能够准确反映P2Y12受体拮抗剂、GPⅡb/Ⅲa受体阻断剂以及中药提取物川芎嗪的抗血小板活性，对于血小板相关基础研究和抗血小板药物筛选平台具有借鉴价值。

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英文摘要

综述:血小板功能检测方法研究进展

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

实验一、流式细胞术与光学比浊法检测血小板聚集率的比较

1 材料与方法

2 实验结果

3 小结

实验二、小鼠血小板聚集率的检测及川芎嗪抗血小板聚集功能的研究

1 材料和方法

2 结果

3 小结

讨论

参考文献

攻读学位期间发表论文情况