丙戊酸诱导白血病细胞凋亡与其影响细胞内谷胱甘肽代谢的研究

摘要

研究背景儿童肿瘤的治疗已取得长足进展，但白血病仍是儿童期最常见的死因之一，大约有30％左右的患儿不能缓解或缓解后复发，最终导致治疗失败。耐药是白血病化疗的主要障碍之一。部分患儿对化疗药物如地塞米松原发耐受，更多患者对药物的耐受发生在强烈化疗之后。因此有必要寻找新的抗白血病药物，尤其是对复发后耐药病例有效的药物。组蛋白乙酰化(Htistone acctylation)修饰染色质结构，在基因转录调节中起着重要作用。总的说来，组蛋白乙酰化导致染色质疏松结构，活化基因转录，而组蛋白去乙酰化作用正好相反。研究表明，许多恶性肿瘤，尤其是白血病中存在组蛋白乙酰化酶(bistone acctyl transferascs，HAT)突变或融合蛋白异常招募组蛋白去乙酰化酶(histonc deacctylascs，HDACs)，导致基因转录受抑的现象。因此组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone dcacctylascs inhibitors，HDACIs)成为实验室或临床研究较多的一类新型药物。越来越多的研究结果表明，HDACIs有希望应用于常规化疗无效的肿瘤。糖皮质激素耐药是ALL成功化疗的一大障碍，因此我们希望了解VPA是否对耐受糖皮质激素的淋巴白血病细胞也有抗肿瘤作用。据文献报道，白血病细胞内谷胱甘肽水平与儿童ALL的临床转归显著相关。GSH水平超过中位数水平者复发率是GSH水平低于中位数水平患者的4.5倍，谷胱甘肽水平是独立的预测复发的指标。虽然ALL幼稚细胞对糖皮质激素(GC)的体外敏感性是否与GSH水平相关尚存有争议，但可以预见，应用药物降低耐药患者白血病细胞内的GSH水平，可能将有助于改善患者的预后。来自临床癫痫患者以及动物实验的资料显示，VPA影响机体红细胞、肝细胞、脑组织以及血浆中的谷胱甘肽氧化还原(GSH-redox)系统，导致氧化应激反应。因此破坏细胞内GSH-redox系统的平衡也有可能是VPA诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一。如果高水平的GSH与Dex耐受成正相关，而VPA又能降低细胞内GSH水平，那么从理论上讲，VIA至少能够部分逆转白血病细胞对地塞米松的耐受。 目的本课题旨在研究(1)VPA对几种不同型别淋巴系或髓系白血病细胞的抗肿瘤作用以及VPA与Dex和Dox有无协同作用；(2)细胞内GSH浓度是否影响细胞对地塞米松或阿霉素的敏感性；(3)VPA对细胞内GSH代谢的影响，亦即细胞内GSH含量和主要抗氧化酶活性在VPA作用下的变化；(4)如果VIA能增强Dex和Dox的抗肿瘤效应，这种效应是否与GSH-redox系统平衡的改变有关；(5)VPA是否增强P-gp+细胞内阿霉素的蓄积量。从而为应用VPA治疗耐药白血病提供理论依据。 方法本实验所采用的细胞系包括T-ALL细胞系Jurkat和CEM,慢性髓系白血病细胞系K562和耐阿霉素的K562/A02，以及急性髓系细胞系HL-60。实验方法包括：(1)MTT试验检测VPA、Dex、Dox单独或联合作用一定时间后的细胞活力，光镜和荧光显微镜下观察细胞形态，比色法检测Caspase3,8,9活性改变，流式细胞分析细胞周期变化和细胞凋亡率。通过Chou-Talalay的方法计算联合指数(Combination index)以评价VPA与地塞米松或阿霉素的交互作用。(2)DNTB比色法检测了各细胞系的基础GSH水平，并将它们与细胞在1μM地塞米松浓度下作用48小时后的生长抑制率作相关分析。(3)检测VPA作用后细胞内GSH/GSSG含量以及谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase，GR)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,Gpx)活性的变化。(4)观察VPA与BSO、NAC和CAT等联合作用下，细胞增殖与凋亡的变化，据此分析GSH-rexiox系统的调节在丙戊酸诱导凋亡中的作用。(5)流式细胞分析VPA作用24小时后，K562/A02细胞摄取阿霉素的能力，以判断VPA是否通过改变细胞内GSH水平影响ABC转运泵的功能。 结果在与临床治疗癫痫的有效血药浓度相似或略高的浓度条件下，单独应用VPA即可对所有受试细胞系产生剂量和时间依赖的增殖抑制效应。按72小时VPA对细胞的IC<,50>大小衡量细胞对VPA的敏感性，则不同细胞的对VPA的敏感性依次为：HI-60>CEM>Jurkat>K562>K562/AO2。VPA活化Jurkat和K562/A02细胞的caspase-3,8,9，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。在VIA和Dex或Dox联合作用下，对Dex相对耐受的Jurkat和对Dox耐受的K562/AO2的细胞抑制率显著增高，VPA的IC<,50>也降至临床有效血药浓度范围以内，联合指数小于1，提示VPA和Dex或Dox之间具有协同作用。根据72小时细胞抑制率与细胞内基础GSH水平作回归分析的结果，认为细胞内基础GSH水平与Dex敏感性无明显相关性，但在VPA处理后8小时和24小时，Jurkat细胞和K562/A02细胞内GSH总量和还原型GSH均显著降低，还原型GSH的变化幅度远大于GSSG。同时谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性均明显下降，提示VPA抑制GR，从而抑制GSSG向GSH的转化。NAC和CAT减弱VPA诱导的凋亡，而谷胱甘肽的消耗可增强VPA诱导的凋亡和细胞周期阻滞的作用。最。后，流式细胞术检测结果显示，BSO有较弱的增加细胞内Dox蓄积的能力，VPA并不增加K562/A02细胞内的Dox浓度。 结论以上结果表明VPA对人类白血病细胞具有剂量依赖的抗肿瘤效应。VPA与Dex具有协同抑制耐糖皮质激素的Jurkat细胞的能力，VPA也可增强耐阿霉素的K562/AO2细胞对阿霉素的敏感性，但这种作用可能与细胞内药物浓度改变无关。在VPA抑制细胞增殖、诱导周期阻滞或细胞凋亡的早期即可观察到GSH的下调与氧还平衡的破坏，可能是由于VPA抑制了细胞内氧化酶GR、GPx活性，导致细胞内氧化应激反应有关。以上结果提示丙戊酸应用于临床上耐受地塞米松或阿霉素的白血病患者可能会有一定疗效。

目录

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主要中英文缩写词一览表

前言

第一部分 丙戊酸对白血病细胞的抗肿瘤作用及其与地塞米松和阿霉素的联合效应 前言

第一部分 丙戊酸对白血病细胞的抗肿瘤作用及其与地塞米松和阿霉素的联合效应 材料与方法

第一部分 丙戊酸对白血病细胞的抗肿瘤作用及其与地塞米松和阿霉素的联合效应 结果

第一部分 丙戊酸对白血病细胞的抗肿瘤作用及其与地塞米松和阿霉素的联合效应 讨论

第二部分GSH、GR、GPx在VPA诱导凋亡过程中的变化 前言

第二部分GSH、GR、GPx在VPA诱导凋亡过程中的变化 材料与方法

第二部分GSH、GR、GPx在VPA诱导凋亡过程中的变化 结果

第二部分GSH、GR、GPx在VPA诱导凋亡过程中的变化 讨论

全文总结

参考文献

综述

致谢