舌癌患者自体CIK细胞的体外培养及其免疫活性的研究

摘要

过去几十余年肿瘤免疫研究取得很大成就，已初步阐明肿瘤免疫的主要机制，为各项研究的深入开展创造了条件。在这段时间里，先后发现了多种具有抗肿瘤活性的效应细胞，如LAK、TIL、CIL等。但这些效应细胞都有各自的局限性，LAK细胞抗肿瘤活性的维持依赖于高浓度外源性IL-2，临床应用受到一定限制。TIL和CIL虽然对肿瘤有特异性杀伤作用，但能活得的细胞数量有限。CIK属新型有高度体外扩增能力非MHC限制性的肿瘤效应细胞，已有实验证明CIK比其他类型免疫细胞有更强的抗肿瘤活性，对多种肿瘤类型均有杀伤作用，具有广阔的临床应用前景。鳞状细胞癌是头颈部恶性肿瘤中最常见的组织类型。统计资料显示，在我国，舌癌占口腔癌构成比的30％-50％，发病率为0.4-0.6/10万，每年都有大量的新增病例。舌鳞癌具有独特的生物学行为，肿瘤侵袭能力强，容易发生淋巴结转移。中晚期舌癌治疗的难度大，临床强调采用综合治疗，除了手术、放疗和化疗以外，肿瘤的生物治疗日益受到重视，与舌癌有关的细胞免疫研究正逐步开展。本实验将初步探讨舌癌患者自体CIK细胞对人舌癌细胞系Tca8113的抗肿瘤活性。 目的： ①分别探讨舌癌患者及正常人外周血CIK细胞的增殖能力、细胞表型、和对Tca8113细胞的细胞毒作用。 ②观察CIK细胞体外诱导培养过程中分泌的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)等含量的变化。 ③研究舌癌患者LAK细胞、CD3AK细胞增殖能力、和对Tca8113细胞的细胞毒作用并与舌癌患者自体CIK细胞作比较。 ④为寻求舌癌患者自体CIK细胞对舌癌过继免疫治疗的新途径提供实验依据。 方法： 提取20例舌癌患者和20例健康捐献者的外周血，经密度梯度离心分离外周血单核细胞，即提取外周血单核细胞中非贴壁细胞用含10％人AB型血清的RPM11640悬浮细胞，加入IFN-γ，培养24小时后转移到经抗CD3mAb包被的培养瓶，加入IL-2和IL-1βB共同培养诱导CIK细胞，定期换液，培养过程中进行细胞形态观察和细胞计数，了解细胞扩增能力； ①流式细胞仪检测CIK细胞动态表型特征，用MTT法检测各效应细胞对舌鳞癌细胞系Tca8113的杀伤活性； ②分别取不同时段CIK细胞的培养上清液0.5ml，用酶联免疫的方法检测其培养上清液中IFN-γ、IL-2、TNF-α的含量变化； ③同时培养舌癌患者LAK细胞、CD3AK细胞并与舌癌患者CIK细胞在增殖能力和对Tca8113杀伤活性上作比较。资料用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，P<0.05为差异有显著性。 结果： 舌癌患者20ml外周血经过一个周期培养平均获得的CIK细胞数低于健康对照组(P<0.05)，但舌癌患者CIK细胞经过周期培养也较培养前的数量明显增高，于12-21d达高峰。 ① CIK细胞培养过程中其上清液IL-2、TNF-α、INF-γ含量随时间增长而升高，至2周左右达最高峰，随后有下降趋势，表明CIK细胞在培养过程中其自身可以分泌多种具有抗肿瘤作用的细胞因子，从而间接反映CIK细胞在体外培养2周左右具有较大生物学活性；②舌癌患者CIK细胞与同体来源的LAK细胞相比细胞增殖倍数和杀伤活性均明显提高(P<0.05)。舌癌患者CIK细胞与舌癌患者CD3AK相比细胞增殖倍数早期无明显差异但后期增殖倍数及杀伤活性有显著提高(P<0.05)。 结论： 人舌癌患者外周血悬浮生长的单核细胞经IFN-γ、抗CD3mAb、IL-2和IL-1β等细胞因子序列诱导后可大量扩增富含CD3+CD56+双阳性细胞的CIK异质细胞群，培养后明显提高CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞的比例(P<0.05)，CD3+、CD3+CD8+细胞也较培养前显著增加(P<0.05)，而CD3+CD4+和CD3-CDs6+的百分率则明显下降。 ①CIK细胞可分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子，且在培养2周左右时量最大，提示此时CIK细胞具有较大生物学活性，实验结果提示CIK细胞可能通过其自身分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子参与抗肿瘤作用。 ②人舌癌患者CIK体外增殖倍数和对Tca8113的杀瘤活性明显优于LAK和CD3AK细胞，低于正常人CIK的增殖能力，而舌癌患者CIK细胞杀伤活性与正常人来源CIK细胞差异无统计学意义(P>0.05)，有望作为自体过继免疫治疗舌癌的一种新方法。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

1前言

2材料和方法

3结果

4.讨论

5全文小结

参考文献

附录:个人简历

致谢

综述：DCCIK的免疫特性及其在颌面头颈肿瘤中的应用

附图