成骨生长肽对骨髓间充质干细胞成骨分化机制及其对OPG<'-/->小鼠的体内作用研究

摘要

目的： 成骨生长肽(osteogenic growth peptide，OGP)是一种在哺乳动物体内广泛存在的多肽，由14个氨基酸组成。我们在体外人工合成了成骨生长肽，已经发现它在体内和体外具有明显的促成骨作用。骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于体内的具有多向分化能力的成体干细胞，其分化方向与其所处的微环境等密切相关。 本实验的第一部分主要研究正常青壮年、绝经后骨质疏松及老龄骨质疏松三种状态下人BMSCs成骨成脂分化的能力差异；第二部分主要研究不同浓度的sOGP对上述三种人BMSCs增殖及分化的影响，以验证sOGP促成骨抑制成脂肪分化的作用是否在BMSCs的水平来实现。OGP对骨髓髓样细胞的促造血分化是通过RhoA的途径实现的，而在BMSCs的成骨成脂分化中RhoA/ROCK途径起着十分重要的作用。实验的第三部分研究了sOGP作用于BMSCs后RhoA/ROCK途径相关蛋白的表达变化，从而探讨sOGP作用于BMSCs可能的分子机制。实验第四部分使用sOGP对一种高转换型骨质疏松模型——骨保护素基因敲除小鼠模型进行干预，不仅探讨OGP对高转换型骨质疏松模型是否具有促骨量增加的治疗作用，同时也在除去骨保护素影响的条件下，为进一步研究OGP可能的促成骨机制进行有益的探索，并提供体内实验的基础。 方法： 第一部分：采用密度梯度离心法和贴壁分离法相结合获得比较均一的正常青壮年状态下、绝经后骨质疏松状态下及老龄骨质疏松状态下人BMSCs。采用倒置显微镜和电子显微镜观察这三种状态下BMSCs在常规培养液、经典地塞米松成骨诱导培养液及盐酸罗格列酮成脂诱导培养液干预下的形态变化。使用MTT法检测三种状态下BMSCs在常规培养液情况下的细胞增殖情况并绘制生长曲线。采用RealtimePCR、化学定量及组织化学染色检测三种状态下BMSCs在经典成骨诱导液培养下碱性磷酸酶的表达；采用RealtimePCR检测不同状态下BMSCs在成脂诱导液培养下PPAR-γ2的表达，采用油红O染色观察各组别脂滴的出现情况；采用组织化学及免疫组织化学染色检测不同状态下BMSCs在经典地塞米松成骨诱导液培养下Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)及骨钙素(OC)的表达。以上各结果进行定量分析后三组间比较。第二部分：研究不同浓度sOGP对三种不同状态下人BMSCs增殖和促成骨抑制成脂分化的影响。对细胞形态观察、细胞增殖率和成骨成脂标志物表达的检测方法与实验第一部分基本相同。进行定量分析后，于各组间和组内比较其差异。第三部分：研究sOGP作用于人BMSCs后细胞内RhoA/ROCK细胞骨架通路相关指标的表达变化。使用免疫荧光染色检测ROCK及actin在干预后第0、1、3、5、8、11、14天的表达和形态改变。使用Western-blot免疫印迹法检测RhoA/ROCK途径中相关蛋白(pFAK、RhoA、confilin)及其激活形式(磷酸化)的表达水平变化。使用RhoA/ROCK通路特异性抑制剂(Y-27632)共同干预细胞后，再次使用免疫荧光染色和Western-blot检测相关蛋白表达的改变情况，观察其对sOGP促成骨作用的影响。 第四部分：研究sOGP对骨保护素基因敲除(OPG<'-/->)小鼠模型促骨量增加的作用。首先比较7周龄、13周龄的OPG<'-/->小鼠与OPG野生型小鼠之间骨密度(整体及第 3 腰椎椎体)、血生化指标(ALP、ACP及OC)、影像学和扫描电镜观察的差别。随后单独使用高、中、低剂量sOGP(10<'-7>mol/kg.d、10-<'-9>mol/kg.d、10<'-11>mol/kg.d)或联合鲑鱼降钙素与高、中、低剂量sOGP共同对OPG<'-/->小鼠干预 6 周，与注射生理盐水的阴性对照组和注射鲑鱼降钙素的阳性对照组进行比较，分别检测骨密度，血生化指标(ALP、ACP 及 OC)，影像学摄片和扫描电镜观察，了解 sOGP 对 OPG<-/->小鼠模型是否存在增加骨量治疗骨质疏松的作用。 结果： 第一部分：老龄骨质疏松状态下BMSCs在常规培养下细胞形态与正常青壮年状态下及绝经后骨质疏松状态下BMSCs无明显差异，但细胞增殖速度明显较慢，电镜显示其粗面内质网和线粒体均较少。成骨诱导后，正常青壮年组和绝经后骨质疏松状态下BMSCs ALP的表达在。mRNA水平和蛋白质水平均显著高于老龄骨质疏松状态下BMSCs；Col-I的表达及钙结节集落的存在经定量分析亦提示，老龄状态下BMSCs要低于余两组的定量值。成脂诱导后，绝经后骨质疏松组及老龄骨质疏松组BMSCs较正常青壮年状态下BMSCs先出现脂滴，PPAR*γ2在mRNA水平的表达及油红O染色定量分析结果均高于正常青壮年组。 第二部分：不同状态下BMSCs加入sOGP后，均出现形态的明显改变，随着培养时间的延长出现致密细胞结节，但老龄骨质疏松状态下出现致密结节时间稍晚。sOGP对BMSCs增殖作用的影响与BMSCs的状态及sOGP的浓度有关：正常青壮年组及绝经后骨质疏松组在sOGP10<'-7>-10<'-9>mol/kL浓度下呈现轻度促增殖作用，而sOGP对老龄骨质疏松状态下BMSCs仅在10<'-7>mol/L浓度下呈现轻度促增殖作用。RealtimePCR、RT-PCR、细胞染色及ALP测量等定量分析结果提示，sOGP在10<'-9>mol/L浓度对不同状态下BMSCs均具有最强的促成骨作用，并亦强于各自状态下经典地塞米松诱导成骨水平。在混合培养干预下(sOGP 10<'-9>mol/L+成脂诱导液)，不同状态下PPAR-γ 2的mRNA的表达较单纯成脂诱导培养下的表达明显降低，油红O染色定量分析后发现不同状态下BMSCs的染色阳性率也有明显下降。 第三部分：免疫荧光染色发现，细胞内ROCK的表达在干预后的第3天起逐渐升高，至第8-11天到达高峰平台期，随后开始下降；细胞内actin的表达发现，干预前细胞呈长梭形，actin平行排列，干预后第8天细胞形态已呈现立方多角形，细胞外围出现粗厚的肌动蛋白束。Western-blot检测发现，sOGP干预后，confilin及RhoA的表达在各时间点均未见明显变化，而pFAK在干预后第1天起开始升高，第3-5天到达平台高峰期，随后开始下降；活化RhoA在干预后第2天开始升高，至第4-8天到达平台高峰期；而磷酸化confilin的表达在干预后第5天开始升高，第8天到达峰值，随后稍有下降但仍维持在较高水平直至第14天。 第四部分：与OPG<'-WT>小鼠相比，OPG<'-/->小鼠的骨密度显著降低(P<0.01)，血清ALP和ACP明显升高(P<0.01)，OC在早期与对照组无明显差异。OPG<'-/->小鼠在 X 线平片上表现为骨量减少，骨小梁稀疏或塌陷，骨皮质变薄。扫描电镜观察到OPG<-/->小鼠骨小梁变细、变尖，骨小梁间隙增大，部分骨小梁塌陷。使用sOGP干预后发现，无论是单独应用sOGP高、中、低剂量组还是联合鲑鱼降钙素sOGP高、中、低剂量组其骨密度均高于注射生理盐水的阴性对照组(P<0.01)，联合用药sOGP中、低剂量组骨密度高于单纯注射鲑鱼降钙素的阳性对照组(P<0.05)。各实验组血ALP及OC的浓度均高于阴性对照组(P<0.05)，血ACP浓度均低于阴性对照组(P<0.05)。各实验组与阴性对照组相较，X线平片表现骨量较高，骨皮质较厚，股骨远端骨小梁塌陷区明显减小；扫描电镜观察到骨小梁较粗、密集，完整性好。 结论： 1、正常青壮年、绝经后骨质疏松及老龄骨质疏松人骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨成脂分化能力有明显差异。 2、合成成骨生长肽(sOGP)对三种状态下人骨髓间充质干细胞(BMSCs)有明显的促成骨分化和抑制成脂分化的作用。这种作用的强弱与sOGP的浓度相关，在10<'-9>mol/L的浓度下，其促成骨分化的能力最强。 3、合成成骨生长肽(sOGP)对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)的促增殖作用与其浓度及．BMSCs所处状态相关。在正常青壮年状态下和绝经后骨质疏松状态下的BMSCs，sOGP在10<'-7>-10<'-9>mol/L均有轻度促增殖作用；而老龄骨质疏松状态下的 BMSCs，sOGP仅在10<'-7>mol/L浓度下才有轻度促增殖作用。 4、sOGP通过RhoA/ROCK细胞骨架通路诱导人BMSCs向成骨细胞分化；由于FAK直接接受整合素或可溶性细胞因子刺激，因此该通路也可能是成骨分化的细胞内起始通路。阻断RhoA/ROCK细胞骨架通路可以阻断sOGP的促成骨作用，而使BMSCs向脂肪方向分化。 5、国内首次对OPG基因敲除(OPG<'-/->)小鼠模型的生物学特征进行观察，OPG<'-/->小鼠模型是一种高转换型骨质疏松模型，为骨质疏松的研究提供了一个可行的、良好的实验平台。 6、sOGP可以促进OPG<'-/->小鼠骨量的增加，并可能存在抑制破骨活性的能力；联合鲑鱼降钙素使用，可能发生叠加或协同作用，促OPG<'-/->小鼠骨量增加的作用更强，为骨质疏松的治疗提供新的方向。对抑制破骨活性的机制需进一步研究。

目录

声明

前言

第一部分：三种不同状态下人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨成脂能力的比较

一、人骨髓间充质干细胞的分离和培养

二、各组人BMSCs的形态学观察

三、各组人BMSCs增殖的比较

四、各组别细胞内碱性磷酸酶(ALP)含量检测

五、Real-time PCR法检测各组成骨、成脂标志物的mRNA表达

六、细胞爬片组织化学和免疫组织化学染色及图像分析

讨论

第二部分：合成成骨生长肽(sOGP)对不同状态下人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖分化的影响

一、sOGP对不同状态下人BMSCs作用的形态学观察

二、sOGP对各组人BMSCs增殖的影响

三、sOGP干预后各组细胞内碱性磷酸酶含量检测

四、Realtime-PCR法检测各组别ALP的mRNA表达

五、RT-PCR法检测各组别骨钙素(OC)的表达

六、细胞爬片组织化学和免疫组织化学染色及图像分析

七、sOGP对不同状态下人BMSCs成脂分化的影响

讨论

附表及附图

第三部份：合成成骨生长肽(sOGP)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)促成骨作用的机制研究

一、sOGP作用于BMSCs后免疫荧光染色及分析

二、sOGP作用后细胞内confilin激活的变化

三、sOGP作用后细胞内pFAK的变化

四、sOGP作用后细胞内RhoA的检测

五、sOGP作用后细胞内活化RhoA的检测(Pull-Down技术)

六、ROCK抑制剂Y-27632对BMSCs向成骨分化影响的细胞内ALP检测

七、ROCK抑制剂Y-27632对BMSCs向成骨分化影响的组织化学染色

八、ROCK抑制剂Y-27632对BMSCs向成骨分化影响的免疫荧光染色

九、ROCK抑制剂Y-27632对BMSCs内pFAK及磷酸化confilin的影响

讨论

第四部分：合成成骨生长肽（sOGP）对骨保护素（OPG）基因敲除小鼠体内作用的研究

一、实验材料

二、OPG基因敲除小鼠骨质疏松症生物学特征观察

三、合成成骨生长肽（sOGP）对OPG基因敲除小鼠体内作用的研究

讨论

结论

参考文献

综述 成骨生长肽及其促成骨作用

致谢

文章撰写及发表、大会发言