外周血淋巴管内皮祖细胞诱导分化以及细胞因子对淋巴管内皮祖细胞趋化和动员的作用

摘要

目的:研究外周血中CD34<'+>/CD 133<'+>/VEGFR-3<'+>LEPCs(lymphatic endothelial progenitor cells)的生物学特征，探讨VEGF-C/VEGFR-3信号途径在淋巴管内皮祖细胞向淋巴管内皮细胞分化中的作用。研究VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF对CD34<'+>/CDl33<'+>/VEGFR-3<'+>LEPCs趋化迁移和体内动员的作用。 方法:用Percoll密度梯度离心法从外周血分离单形核细胞，再用流式细胞仪从单形核细胞分选VEGFR-3<'+>细胞。共聚焦激光扫描显微镜下观察VEGFR-3<'+>细胞的CD34和CD133表达以及CXCR-4的表达。通过VEGF-C诱导使LEPCs细胞向淋巴管内皮细胞分化。在共聚焦激光扫描显微镜下观察由LEPCs分化而成的淋巴管内皮细胞的LYVE-1和5-核苷酸酶的表达，并在扫描电镜和透射电镜下观察LEPCs在分化过程中的表面形态和超微结构变化。通过跨膜迁移实验观察VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF对LEPCs的趋化作用，用扫描电镜观察迁移细胞的形态特征。在小鼠皮下分别注射VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF，用流式细胞仪检测外周血单形核细胞中LEPCs数目，同时用全自动血样分析仪计数白细胞。 结果:外周血中VEGFR-3<'+>细胞同时表达CD34和CD133。外周血单形核细胞中的CD34<'+>/VEGFR-3<'+>细胞为0.13％，VEGFR-3<'+>/CD133<'+>细胞为0.08％。LEPCs的体积比单纯CD34<'+>细胞大，直径约为15μm。经VEGF-C诱导后，细胞数目增多。细胞变为梭形，伸出板状伪足和许多丝状伪足。诱导后1周，细胞表达第Ⅷ凝血因子相关抗原。诱导后2周，细胞表面出现小凹，细胞内可见Weibel-Paladedx体，表达淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1和5-核苷酸酶，CD133表达消失。LEPCs细胞的细胞膜表达CXCR-4。细胞跨膜实验显示，与对照组相比，VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF组跨膜迁移细胞的百分率增大，用VEGFR-3和CXCR-4阻断抗体处理后VEGF-C和SDF-1对LEPCs的趋化迁移作用明显降低。注射VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF后，小鼠外周血中LEPCs的数量明显增多。未检测到白细胞发生明显变化。 结论:在VEGF-C诱导作用下，外周血中的CD34<'+>/CD133<'+>/VEGFR-3<'+>LEPCs能向淋巴管内皮细胞分化。VEGF-C/VEGFR-3信号途径在LEPCs的分化过程中起着重要作用。VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF对LEPCs有趋化迁移和动员作用，VEGF-C/VEGFR-3和SDF-1/CXCR-4信号途径在LEPCs趋化迁移方面起着重要调控作用。

目录

论文说明:英文缩写

声明

前言

第一部分外周血淋巴管内皮祖细胞的分选及其向内皮细胞的诱导分化

材料和方法

1.1实验材料

1.2仪器和试剂

1.3狗外周血单形核细胞的分离

1.4流式细胞仪分析

1.5 LEPCs的分选和鉴定

1.6 LEPCs的诱导分化和分化细胞的免疫荧光鉴定

结果

1 外周血CD34+/VEGFR-3+和CD133+/VEGFR-3+细胞的数目

2 外周血LEPCs的形态特征

3 LEPCs分化为内皮细胞的特征性标志物

4 LEPCs的超微结构

讨论

第二部分细胞因子对淋巴管内皮祖细胞趋化和动员的作用

材料和方法

1.1材料

1.2仪器和试剂

1.3狗外周血单形核细胞的分离

1.4 LEPCs跨膜迁移实验

1.5 LEPCs的体内动员

1.6统计学分析

结果

1. LEPCs的特征性标志物

2. 细胞因子对LEPCs的趋化迁移作用

3. 细胞因子对LEPCs的动员作用

讨论

全文小结

参考文献

综述 内皮祖细胞与肿瘤血管新生

在校期间发表论文

致谢