流行我国的弓形虫分离株基因分型及其毒力研究

摘要

目的:本实验主要目的是观察流行我国的人及动物源性弓形虫基因型及其毒力,并检测优势基因型Chinese1型成囊株在小鼠体内的动态分布,以期为弓形虫病的诊断,治疗和疫苗研发提供实验依据。
　　方法:分别从安徽,广东,江苏,湖北和山东五省收集猫的标本和弓形虫感染病人以分离人及动物源性弓形虫株。抽提弓形虫DNA,采用PCR-限制性片段长度多态性分析(RFLP)方法在 SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1和Apico位点分析流行我国弓形虫的基因型。PCR反应体系包含25μl PCR master mix、10μm的上下游引物、1.5μl的DNA模板和21.5μl的无菌水,共50μl。各位点 PCR反应产物纯化后经相应的内切酶酶切,酶切产物电泳图谱与参考虫株图谱相比较进而确定我国弓形虫株的基因型。
　　为了探究流行我国不同基因型弓形虫株的小鼠毒力,用各基因型的代表性虫株1′103个速殖子腹腔注射SPF级KM小鼠,逐日观察并记录小鼠的发病及死亡情况;随后提取各虫株的 mRNA,采用逆转录荧光定量PCR(qRT-PCR)检测毒力相关因子ROP2、ROP4、ROP5、ROP16、ROP18、GRA2、GRA3、GRA5、GRA7、GRA15和MIC6的表达量。取Chinese1型弓形虫成囊株TgCtwh6的包囊50个经口感染SPF级KM小鼠,于感染后第2、4、7、10、14、21、35、50和72天,大体观察小鼠健康状况并测定体重;颈椎脱臼法处死小鼠,脑组织压片观察弓形虫包囊形成时间,计算小鼠成囊率,测量包囊直径;同时采用荧光定量PCR和组织接种方法检测弓形虫在血液、心脏、肝脏、脑和淋巴结组织中的动态分布。
　　结果:本研究共分离动物源性弓形虫19株,人源性弓形虫4株,对本室分离的23株弓形虫进行基因分型,共揭示了5种基因型,其中3种基因型为非典型,余下2种为原型谱系。这些非典型谱系被分别命名为ToxoDB＃9(Chinese1),ToxoDB＃204和 ToxoDB＃205。在23株人源性及动物源性弓形虫中,有15株(65.22％)属于Chinese1型谱系,基因型Chinese1在SAG2,GRA6,L358,PK1,c22-8位点为II型图谱,在c29-2,SAG3和BTUB位点显示为III型图谱,而在Apico位点则为I型图谱。基因型ToxoDB＃204在SAG1位点显示为异常的图谱,余下九个位点则和Type II型图谱一致,暗示他们可能有种群相关性。基因型ToxoDB＃205为I型和II型的混合图案,在SAG3和L358位点为I型图谱,在SAG2,BTUB,GRA6,c22-8,c29-2,PK1和Apico位点为II型图谱,而在SAG1位点则为II型或者III型谱系。基因型ToxoDB＃204和205在中国大陆此前未见报道,在本研究中没有发现Type III型谱系。
　　流行我国不同基因型的弓形虫株1′103个速殖子腹腔感染SPF级KM小鼠,优势基因型Chinese1型弓形虫感染小鼠后,能在1周内致死所有小鼠;然而弓形虫TgCtwh6(Chinese1)速殖子感染小鼠后只出现一过性的炎症反应且在存活小鼠脑内发现大量的包囊。腹腔接种弓形虫TgCtxz5和 TgCtxz8(ToxoDB＃205)1′103个速殖子,感染小鼠在5-7天内死亡。毒力相关因子mRNA表达量检测,强毒株ROP16的表达量明显增加(P<0.001);弱毒株GRA3呈过度表达(P<0.001)。
　　KM小鼠经口感染弓形虫TgCtwh6包囊50个,第4天即在血液、心、肝和淋巴结组织中检测到弓形虫。感染后第7天,实验鼠脑组织中首次检测到弓形虫DNA(5.52×104copies/ml),第14天脑组织中虫体显著增多(P<0.05),21天达到最多(9.10′106copies/ml),此后脑组织中虫体稳定存在并一直持续到实验结束。弓形虫TgCtwh6感染后第21天,脑组织压片首次查获包囊。血液中虫体随时间推移逐渐增多,4天时显著增多(P<0.05);7天达到最高(7.44′104copies/ml),以后逐渐下降;第35天,血液中虫体检测不到。
　　结论:1.本实验探究了流行我国的人及动物源性弓形虫基因型,证实Chinese1型基因型为优势基因型(78.33%)。2.发现了两个新的基因型(ToxoDB＃204和205)在弓形虫基因型数据库(www.toxodb.org)中未见报道。3.通过毒力相关因子表达量检测,发现强毒株高表达ROP16而弱毒株高表达GRA3。4.观察了优势基因型Chinese1型成囊株TgCtwh6在小鼠体内的动态分布,揭示了口服摄入包囊后,虫血症可持续至少35天,为我国弓形虫病的诊断提供实验依据。

目录

封面

声明

目录

中英文缩略词对照表

中文摘要

英文摘要

1. 前言

2. 材料和方法

2.1 材料和试剂

2.1.1 实验动物及虫株

2.1.2 引物

2.1.3 主要试剂

2.1.4 部分试剂的配制

2.1.5 实验所用仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 弓形虫循环抗原（CAg）检测

2.2.2 弓形虫IgM抗体检测

2.2.3 弓形虫IgG抗体检测

2.2.4 弓形虫间接血凝试验

2.2.5 人源性弓形虫的分离

2.2.6 猫源性弓形虫的分离

2.2.7 弓形虫复苏与冻存[28]

2.2.8 弓形虫DNA提取

2.2.9 弓形虫目的基因的扩增

2.2.10 PCR产物的纯化

2.2.11 PCR产物的酶切

2.2.12 弓形虫总RNA提取

2.2.13 测定RNA纯度和浓度

2.2.14 逆转录合成第一链cDNA

2.2.15 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

2.2.16弓形虫TgCtwh6脑包囊分离和纯化

2.2.17弓形虫TgCtwh6在小鼠体内动态分布检测

2.2.18 实时荧光定量PCR（qPCR）

3. 结果

3.1 弓形虫病人临床资料

3.2 不同地区猫标本检测结果

3.3 流行我国弓形虫株基因分型结果

3.4 流行我国弓形虫株小鼠毒力

3.5 弓形虫TgCtwh6（Chinese 1）在小鼠体内的动态分布

3.6 流行我国不同基因型的弓形虫株毒力相关因子检测

4. 讨论

5. 结论

参考文献

附录一：个人简历

致谢

附录三：综述