人和羊IgG诱导细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合噬菌体文库不同的体外进化结果

摘要

金黄色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal proteinA,SpA)和链球菌蛋白G(streptococcal proteinG,SpG)是细菌产生的特异结合宿主抗体的细菌免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin(Ig)-bindingproteins,IBPs)的代表分子。SpA和SpG均包含由多个的序列高度同源的结合结构域重复组成的抗体结合区,各单结构域都具有完全的结合IgG的功能。
　　本研究构建了两个由SpA和SpG各单结构域随机组成的噬菌体展示文库,通过人和羊IgG对这两个文库进行亲和筛选,以期能够获得对人和羊IgG具有特异优势结合能力的组合分子。使用PCR扩增法制备SPA(A、B、C、E)、SPG(B2、B3)以及SPA(A、B、D、E)、SPG(B2、B3)各结构域核苷酸片段,在片段两端通过引物引入XbaⅠ酶切位点和保护碱基,同时在3’端引入3个氨基酸大小的随机连接肽核苷酸序列,经XbaⅠ酶消化各结构域核苷酸片段,在LH连接酶作用下随机相互连接并克隆于噬菌粒载体pCANTAB5S,并转化TG1细胞,经M13K07辅助噬菌体拯救,得到Ig结合分子单结构域随机组合噬菌体展示文库。用人和羊IgG同时对两个文库进行亲和筛选,每一轮筛选后均随机挑选单克隆进行PCR鉴定,检测片段插入的大小分布情况,以评价筛选有效性;同时对筛选后文库中的单克隆进行序列测定,获得展示序列终单结构域的排列组合情况。筛选结果统一后,制备最终得到的各特异优势组合分子的单克隆噬菌体,通过噬菌体ELISA的方法来比较其与人和羊IgG的结合特性。
　　本研究成功构建了噬菌体展示SpA(A、B、C、E)、SpGB2、B3)(库C)以及SpA(A、B、D、E)、SpG(B2、B3)(库D)共六个单结合结构域随机组合文库。其中单结构域随机组合文库库C的库容为8.5×106,噬菌体库滴度为1.82×1012TU/Ml,PCR鉴定阳性片段插入率为78％(其中1个domain的组合占50%;2个domain的组合占16.7%;3个及3个以上domain的组合占8%);库D的库容为8.1×106,噬菌体库滴度为1.69×1012TU/Ml,PCR鉴定阳性片段插入率为72%(1个domain的组合占40%;2个domain的组合占19.4%;3个及3个以上domain组合,占9.5%)。测序结果显示,各单结构域组合情况、正反向插入情况、连接肽均呈现随机分布,所建文库符合进行体外进化筛选要求。筛选最均获得了SpA天然分子中不存在的单结构域排列组合分子,库C经过人IgG诱导四轮筛选后,片段大小统一为2个domain,测序分析后组合为A-C,库C经过羊IgG诱导六轮筛选后,片段大小统一为2个domain,测序分析后组合为A-B3。库D经过人IgG诱导六轮筛选后,片段大小统一为3个domain,测序分析后组合为E-B-B3,库D经过羊IgG诱导六轮筛选后,片段大小统一为4个domain,测序分析后组合为D-A-B3-B3。噬菌体ELISA进一步证实库C得到的组合分子A-C对人IgG的结合能力高于组合分子A-B3,而组合分子A-C对羊IgG的结合能力低于于组合分子A-B3,与筛选结果完全吻合;然而,与库C筛选结果不同的是,库D得到的组合分子D-A-B3-B3对人和羊IgG的结合能力都高于组合分子E-B-B3,未显示出抗体结合的特异性。
　　本研究成功使用人和羊IgG诱导细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合噬菌体文库完成体外进化筛选,分别获得到了与人和羊IgG具有不同结合优势的新型组合分子A-C、A-B3、E-B-B3、D-A-B3-B3,其中只有库C得到的新型组合分子分别与人和羊IgG具有特异性结合能力。本研究还可为细菌IBP结构功能以及IgG的Fc段结合分子的进一步研究提供新的手段;并为IgG的纯化、制备、检测提供了新的应用前景。

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前言

第一部分噬菌体展示Ig结合分子单结构域随机组合文库的构建

一 材料与方法

1 材料

2 方法

二 实验结果

三 讨论

第二部分应用人和羊IgG对噬菌体展示文库体外进化筛选

一 材料和方法

1 材料

2 实验方法

二 结果

3.1 用人和羊IgG对库C和库D进行亲和筛选结果

3.2 人和羊 IgG 对噬菌体展示文库筛选结果测序

三 讨论

总结

参考文献

附录

致谢

噬菌体展示库技术及其在抗大肠癌的抗体的筛选及表达中的应用进展