高效降解羽毛的微白黄链霉菌Fea-10的分离鉴定及其角蛋白酶基因的异源表达

摘要

角蛋白酶(keratinase)是一类可以降解顽固的角蛋白（如羽毛、羊毛、头发等）的蛋白酶，广泛存在于自然界中。角蛋白酶一般可以分类为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。由于角蛋白不能被普通的蛋白酶降解，且数量巨大，每年都会有数百万吨的含角蛋白废弃物产生，但是它们并不会在自然界中堆积，这种要是角蛋白降解微生物产生的角蛋白酶将这些废弃物分解，从而减轻了环境的负担。目前，已知细菌、真菌和放线菌中均有可以产生角蛋白酶的菌株，古细菌中也有可以产生角蛋白酶的报道。角蛋白降解微生物可以利用廉价的角质废弃物作为培养基质来产生角蛋白酶，使得角蛋白酶具有较低的生产成本，且角蛋白酶在各种工业领域具有很好的应用，具有很高的利用价值。　　本文在养鸡场堆积羽毛的土壤中，分离得到了一株角蛋白降解菌Fea-10。经过初步鉴定，Fea-10为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus。Fea-10具有很高的角蛋白酶活性，可以完整的降解羽毛。　　通过已知的角蛋白酶的N端序列，在Fea-10基因组中找到两个可能的角蛋白酶基因gm2886和gm2888。这两个基因均由信号肽、前肽和成熟酶三个部分构成。将这两个基因的完整基因分别构建在pET15b-SUMO载体上，转入BL21(DE3)均不能表达;更换为pET28a载体和Rossta(DE3)宿主后，只有gm2888可以获得无活性的包涵体表达;将这两个基因去掉信号肽的酶原基因分别构建在pET22b载体上，转入Rossta(DE3)，只有2886可以获得可溶性表达，但并没有角蛋白酶活性。　　考虑到可能链霉菌表达系统更适于链霉菌来源的角蛋白酶表达并折叠为有活性的成熟酶，使用链霉菌-大肠杆菌穿梭整合型质粒pSET152进行表达。表达宿主菌选择微弱角蛋白酶活的密旋链霉菌ACT12。构建gm2886带有原始启动子和红霉素启动子的表达载体和gm2888带有红霉素启动子的表达载体，分别接合转移导入ACT12。使用牛奶平板初筛接合子，并使用TSBY培养基发酵降解圈大的接合子，使用硫酸铵沉淀后，检测只有gm2886带红霉素的载体有角蛋白酶表达。使用Ni柱纯化重组蛋白，并测定其酶学性质。重组蛋白的最适温度为50℃，最适pH10.0，在40℃保温30min后酶活仍有80％以上。金属离子Ca2+、Mg2+、K+均抑制重组蛋白的活性;PMSF显著抑制重组蛋白的活性，重组蛋白为丝氨酸蛋白酶。重组蛋白对可溶的casein、Azo-casein、BSA和hemoglobin以及不可溶的羽毛和天青角蛋白均有活性。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1．1 角蛋白综述

1．1．1 角蛋白的结构

1．1．2 角蛋白的产生现状和环境危害

1．2 角蛋白酶综述

1．2．1 角蛋白酶的微生物多样性

1．2．2 微生物角蛋白酶的产生条件和降解角蛋白的机制

1．2．3 角蛋白酶的生物化学性质

1．2．4 角蛋白酶生产的经济可行性

1．3 角蛋白酶应用前景

1．3．1 洗涤剂工业

1．3．2 皮革工业

1．3．3 食品饲料工业

1．3．4 有机农业的肥料

1．3．5 线虫抑制

1．3．6 X射线胶片的二次利用

1．3．7 朊病毒蛋白的治疗

1．3．8 生物燃料的生产

1．3．9 其他应用

1．4 角蛋白酶的分子生物学研究进展

1．5 本研究的目的和意义

第二章 菌株Fea-10的分离和分类鉴定

2．1 材料

2．1．1 样品采集

2．1．2 试剂

2．1．3 培养基

2．2 方法

2．2．1 养鸡场堆积羽毛土壤中角蛋白降解放线菌的分离

2．2．2 分离到的菌株Fea-10的16SrDNA序列测序

2．2．3 Fea-10形态特征

2．2．4 Fea-10菌株的生理生化特征检测

2．3 结果与分析

2．3．1 角蛋白降解放线菌的分离

2．3．3 Fea-10菌株的16SrDNA测序结果分析与N-J树构建

2．3．4 菌体形态特征和菌落形态特征

2．3．5 菌株Fea-10生理生化特征

2．4 结论与讨论

第三章 菌株Fea-10角蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

3．1 材料

3．1．1 菌株、质粒和引物

3．1．2 培养基

3．1．3 试剂

3．1．4 抗生素与酶

3．1．5 主要仪器

3．2 方法

3．2．3 感受态细胞的制备及热激法转化感受态细胞

3．2．4 角蛋白酶基因gm2886克隆与测序验证

3．2．5 角蛋白酶基因gm2886在大肠杆菌中的表达

3．2．6 SDS-PAGE电泳检测

3．2．7 角蛋白酶基因gm2888克隆与测序验证

3．2．8 2888pro基因中稀有密码子的定点突变

3．2．9 角蛋白酶基因gm2888在大肠杆菌中的表达

3．3 结果与分析

3．3．1 角蛋白酶基因gm2886和gm2888的发现与序列分析

3．3．2 gm2886基因克隆载体的构建

3．3．3 gm2886基因表达载体的构建

3．3．4 gm2886基因在大肠杆菌中诱导表达

3．3．5 重组蛋白2886pro-His的纯化

3．3．6 gm2888基因克隆载体的构建

3．3．7 gm2888基因表达载体的构建

3．3．8 gm2888基因稀有密码子定点突变

3．3．9 gm2888基因在大肠杆菌中诱导表达

3．4 讨论

第四章 菌株Fea-10角蛋白酶基因在链霉菌中的表达

4．1 材料

4．1．1 菌株、质粒和引物

4．1．3 试剂

4．1．4 抗生素与酶

4．1．5 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 pSET152-2886native-his载体的构建

4．2．2 接合转移

4．2．3 pSET152-erm-2886his载体的构建

4．2．4 pSET152-erm-2888his载体的构建

4．2．5 重组蛋白的纯化及电泳

4．2．6 重组蛋白GM2886-HIS酶活的测定

4．2．7 重组蛋白GM2886-HIS酶学性质的测定

4．3 结果与分析

4．3．1 gm2886基因带有原始启动子的链霉菌表达载体的构建

4．3．2 gm2886基因带有红霉素启动子的链霉菌表达载体的构建

4．3．3 gm2888基因带有红霉素启动子的链霉菌表达载体的构建

4．3．4 接合子牛奶平板初筛

4．3．5 接合子粗酶液SDS-PAGE检测

4．3．8 重组蛋白GM2886-His6的产量与酶活

4．3．9 重组蛋白GM2886-HIS的酶学特性

4．4 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介