Caveolin-1在TNF-α诱导大鼠肺微血管内皮细胞通透性变化中的作用机制研究

摘要

研究背景:
　　急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)是临床常见急危重症,发病机制尚不完全清楚,临床缺乏有效治疗手段,病死率高。尽管已明确炎性介质作用于肺微血管内皮细胞(PMVECs)是导致ARDS的重要原因,但研究表明,单纯通过阻断或封闭炎性介质难以取得理想效果。近些年来,研究的热点逐步转向那些能够将多种信号通路联系在一起,并对它们进行调节的蛋白质身上,如小窝蛋白-1,试图由此开辟一条ARDS发病机制研究的新方向。
　　小窝(Caveolae)又称膜内陷囊泡,是细胞膜表面特异性的内陷囊状结构,广泛分布于机体内,参与细胞分化、增殖、炎症、肿瘤、衰老等多种病理生理过程。Caveolae在调控微血管内皮细胞通透性方面的研究并不多见并且各项研究的结果尚存在很大的争论:部分研究报道小窝蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)的敲除增加血管内皮的通透性,另一部分研究认为敲除Caveolin-1会导致血管内皮通透性的降低。因此,小窝在肺微血管内皮通透性中的作用机制还有待进一步研究。
　　炎症介质如:肿瘤坏死因子-α(TNF-α),内毒素(LPS)和凝血酶等,引起内皮细胞通透性增加,主要是导致内皮细胞间缝隙的形成。而其机制包括:诱导细胞骨架蛋白的重构,导致细胞收缩以及破坏细胞间的连接。而细胞骨架蛋白的重构和细胞间的连接受到多种信号通路的调节。小G蛋白家族由于能够调节细胞间粘附和细胞骨架的动力,很早被认为在调控内皮屏障功能中居于重要的地位,尤其是Rac1可以通过调控内皮细胞骨架蛋白F-actin的重构,加强细胞间的连接,增强内皮细胞的屏障功能。
　　皮质肌动蛋白结合蛋白(cortactin)是广泛存在的酪氨酸激酶的靶点,是Rac1信号通路的主要效应蛋白之一,牵涉到皮层肌动蛋白的组装和重构。目前确定,在内皮功能加强的情况下,cortactin在细胞边界处聚集,导致皮层肌动蛋白分布增加,功能增强,而这一过程依赖于Rac1的激活。在Cortactin基因敲除的内皮细胞,那些能够稳定内皮屏障功能的药物如cAMP、PGE2和PGI2等并不能够降低炎症因子诱导的内皮通透性增高。
　　综上所述,Rac1-cortactin信号通路在血管内皮细胞单层通透性调控中具有重要作用,而caveolin-1对血管内皮通透性的影响是否与该通路有关,目前尚未见报道。
　　目的:
　　构建caveolin-1基因RNA干扰慢病毒,观察抑制caveolin-1基因表达对TNF-ɑ诱导的RPMVECs通透性变化的影响,探讨其作用机制,丰富ARDS的基础理论,并为临床防治ARDS提供新的思路。
　　方法:
　　1.pLL3.7-caveolin-1shRNA慢病毒表达载体构建:确定编码caveolin-1-shRNA的DNA序列,将其克隆至慢病毒表达载体pLL3.7上并进行慢病毒包装、分离以及滴度的测定。
　　2.RPMVECs的分离、培养和鉴定:采用体外肺组织块贴壁法行原代RPMVECs分离、培养。倒置显微镜下观察,RPMVECs形态学特征,并采用植物凝集素结合试验进行鉴定。
　　3.慢病毒(含载体pLL3.7-caveolin-1shRNA)感染RPMVECs及鉴定:慢病毒(含载体pLL3.7-caveolin-1shRNA)感染RPMVECs,感染后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,采用稀释计数法测定病毒滴度,用Western-blotting法鉴定转染RPMVECs中目的蛋白表达情况,确定caveolin-1表达抑制的效率。
　　4.抑制Caveolin-1基因表达对TNF-α引起RPMVECs高通透性的影响及作用机制
　　RPMVECs分为正常细胞、转染目的基因的细胞及转染空载体的细胞。按照如下实验方案分组:正常细胞未刺激组,正常细胞TNF-α刺激组,正常细胞O-Me-cAMP刺激组,正常细胞O-Me-cAMP+TNF-α共刺激组,阴性沉默对照组(controlshRNA),阴性沉默(controlshRNA)细胞TNF-α刺激组,Caveolin-1基因沉默组(Caveolin-1shRNA),Caveolin-1基因沉默细胞+TNF-α刺激组,Caveolin-1基因沉默细胞+NSC23766+TNF-α刺激组。
　　1)抑制Caveolin-1基因表达对TNF-α引起RPMVECs高通透性的影响:采用跨内皮细胞电阻(transendothelialelectricalresistance,TER)、异硫氰酸荧光素标记白蛋白法观察细胞单层通透性变化。
　　2)抑制Caveolin-1基因表达对TNF-α引起肺微血管内皮骨架蛋白重构的影响:免疫荧光染色激光共聚焦观察F-actin和cortactin分布变化;western-blot半定量分析cortactin在胞浆和胞膜量的变化。
　　3)抑制Caveolin-1基因表达对TNF-α引起肺微血管内皮单层通透性变化、内皮细胞骨架蛋白重构产生影响的信号转导机制:Pull-down及western-blot半定量分析Rac1活性。
　　结果:
　　1.经酶切和测序证实,成功构建慢病毒表达载体pLL3.7-caveolin-1shRNA,病毒包装后经浓缩得到的病毒悬液滴度为2×108TU/ml。
　　2.获得原代培养的RPMVECs,经光镜下的细胞形态学特征和植物凝集素结合试验加以鉴定。
　　3.慢病毒感染RPMVECs后,在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光。Westernblotting法可检测到相应目的蛋白表达,24h后即出现caveolin-1的表达抑制,48h抑制caveolin-1的表达至阴性沉默对照组caveolin-1表达水平的60±10％;72h抑制达最小值约为阴性沉默对照组的10±2%。而阴性沉默对照组caveolin-1表达水平在0、24、48、72h变化不大,差异无统计学意义。
　　4.抑制caveolin-1基因表达对TNF-α引起RPMVECs高通透性的影响及作用机制
　　1)抑制caveolin-1基因表达对TNF-α引起RPMVECs高通透性的影响:100ng/mlTNF-α刺激RPMVECs单层时,TER呈时间依赖性下降;在刺激2小时,TER下降最显著,降到基础值的63±5%;FITC-BSA的通透率升高最显著,达到基础值的205±23%;200mMO-Me-cAMP能抑制TNF-α诱导的TER的下降和FITC-BSA通透率的增加。抑制caveolin-1表达,静息状态下TER较controlshRNA组升高到116±10%,FITC-BSA的通透率较controlshRNA组略有降低,但差异无统计学意义(p>0.05)。当caveolin-1shRNA组和controlshRNA组细胞单层受TNF-α刺激2h,caveolin-1shRNA组TER的值降到刺激前的78±7%,controlshRNA组TER的值降到刺激前的59±4%,可见caveolin-1shRNA组TER值下降程度较controlshRNA组为少,两组间比较(78±7%vs59±4%)差异有显著统计学意义(p<0.05);观察FITC-BSA通透率方面变化可见:controlshRNA组在受到TNF-α刺激2h后,FITC-BSA的通透率明显增加到刺激前的197±27%,caveolin-1-shRNA组通透率升高到刺激前的122±11%,两组间比较有显著性差异(197±27%vs122±11%,p<0.05)。敲除caveolin-1可以抵御TNF-α诱导的内皮通透性的增加。Rac1的抑制剂-NSC23766能取消敲除caveolin-1带来的内皮屏障保护效应。
　　2)抑制caveolin-1表达对PMVECsF-actin和cortactin分布的影响:TNF-α刺激control-shRNA细胞2小时可见:F-actin外周致密带边缘变得毛糙不规整、排列紊乱,细胞边界已不可辨,F-actin重组,从细胞周边向细胞中心转移并成平行束状堆积、增厚,细胞中央应力纤维形成,而胞浆中分布的cortactin变得紊乱,皮质区和细胞膜上的分布也变得很不明显;细胞边界模糊,形态不清,而western-blot半定量分析显示膜上cortactin蛋白含量明显减少。caveolin-1-shRNA组:F-actin重组明显,从细胞中央向细胞周边转移并形成皮质区F-actin增厚强化,细胞中央束状应力纤维形成明显减少,细胞伪足形成明显。而胞浆中分布的cortactin明显向膜上转位,在细胞皮质区分布明显,并在细胞膜上成线样强化分布;western-blot半定量分析显示膜上cortactin蛋白含量明显增加。给予TNF-α刺激2h,皮质区F-actin分布强化依旧明显,胞浆区F-actin分布比较紊乱,但细胞中央的束状应力纤维比较明显,细胞伪足形成仍可见到;细胞皮质区和伪足区cortactin分布减少不明显,胞浆区cortactin分布也没有明显减少,western-blot半定量分析显示膜上cortactin蛋白含量较TNF-α刺激前减少不明显,但是较control-shRNA+TNF-α组明显增加。
　　3)抑制caveolin-1表达对Rac1信号通路活性的影响:抑制caveolin-1表达可以增加RPMVEC内Rac1的活性,抑制TNF-α导致的RPMVEC内Rac1活性的降低:在静息情况下shRNA方法沉默caveolin-1基因表达可以明显增加内皮细胞中Rac1酶的活性,较阴性沉默对照组(controlshRNA)升高2.5±0.2倍(n=6,P<0.01);而在TNF-α刺激2h后,caveolin-1-shRNA组Rac1酶的活性是controlshRNA组酶活性的2.7±0.4倍(n=6,P<0.01)。
　　结论:
　　1.成功构建caveolin-1基因表达抑制的RPMVECs单层模型。
　　2.抑制caveolin-1表达,可以减轻TNF-α所致RPMVECs单层通透性的增加。
　　3.TNF-α引起Rac1活性的降低,可能是其导致RPMVECs通透性增高的机制之一。抑制caveolin-1表达可以上调Rac1的活性导致皮质区cortactin和F-actin骨架蛋白分布的增加,加强细胞间连接,从而加强内皮的屏障功能,抵御TNF-α诱导的RPMVECs单层通透性的增加.
　　4.在TNF-α刺激下,特异性阻断Rac1的活性,可削弱caveolin-1表达抑制带来的内皮屏障保护效应。

目录

封面

声明

目录

英 文 缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分Caveolin-1 shRNA慢病毒表达载体的构建及转染原代培养的大鼠肺微血管内皮细胞

1.引 言

2. 材料与方法

3结果

4.讨 论

小结

第二部分Caveolin-1基因表达抑制对TNF-α致大鼠肺微血管内皮细胞单层通透性增高的影响

1. 引言

2. 材料与方法

3. 结 果

4.讨论

小结

第三部分Caveolin-1基因表达抑制对RPMVEC骨架肌动蛋白及皮质肌动蛋白结合蛋白形态学变化的影响

1. 引 言

2. 材料与方法

3. 结 果

4. 讨 论

小结

第四部分Caveolin-1基因表达抑制影响RPMVEC单层通透性变化的信号机制

1.引 言

2. 材料与方法

3. 结 果

4. 讨 论

小结

全文结论

不足之处与展望

参考文献

附 录1

致谢

综述