树突细胞在动脉粥样硬化动脉壁内的分布及耐受性树突细胞对Th17细胞的调节作用

摘要

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种以免疫细胞浸润病变部位以及T淋巴细胞被激活所引起的某些特异性细胞免疫反应为其主要特点的慢性炎症免疫性疾病。树突细胞(dendritic cell,DC)是目前已知的体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC),数量少但分布广,并且能有效捕获、处理相关抗原,随后呈递给T淋巴细胞,通过双信号刺激,激发初级细胞免疫反应。DC在体液免疫应答和特异性细胞免疫的诱导和调节中起重要作用。DC具有免疫原性和耐受性双重作用,DC是否参与了 AS的形成过程报道较少。耐受性树突细胞(Tolerogenic dendritic cells,tolDC)是一种能够下调免疫应答和维持免疫耐受的细胞群,Th17细胞分泌的IL-17是一种强大的促炎性细胞因子,它能上调免疫应答、促进炎症反应,与AS密切相关。多项研究证实,Th17是炎症的主要致病性效应细胞。CD11c+CD11b+tolDC体外是否能调节Th17的功能并且抑制炎症反应,目前尚不清楚。本实验收集了正常及下肢动脉粥样硬化闭塞症（Atherosclerosis obliterans ASO)患者下肢动脉标本,通过观察免疫原性CD1a、CD83、CCR7阳性反应VDC(vascular dendritic cell),以及耐受性CD11b、DC-SIGN、TLR-2和IDO阳性反应VDC在AS病变动脉壁中的分布和含量变化,探讨免疫原性和耐受性DC和AS之间的关系。并且体外诱导分离小鼠CD11c+CD11b+tolDC,研究CD11c+CD11b+tolDC体外对Th17细胞的调节作用。
　　目的:研究免疫原性和耐受性DC在动脉粥样硬化动脉壁内的分布情况,探讨免疫原性和耐受性DC和AS之间的关系;研究骨髓源CD11c+CD11b+tolDC体外对Th17细胞的调节作用。
　　方法:人下肢动脉标本40例主要取自尸检和外科手术,常规石蜡切片,HE染色,10例下肢动脉内膜形态结构未见明显改变的设为正常对照组,30例下肢动脉病变较明显的设为实验组;免疫组化染色观察 S100+、免疫原性CD1a、CD83、CCR7阳性和耐受性CD11b、DC-SIGN、TLR-2、IDO阳性反应VDC的分布;Western blot法检测免疫原性CD1a、CD83和耐受性CD11b、IDO VDC的表达。体外用rmGM-CSF和rmIL-4诱导CD11c+CD11b+tolDC,并用抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1的表达对CD11c+CD11b+tolDC的耐受功能进行鉴定。通过分析CD11c+CD11b+tolDC对 Th17细胞比例及分泌的细胞因子的影响观察CD11c+CD11b+tolDC对T细胞的调节作用。采用实时PCR(real-time PCR,RT-PCR)检测IL-17 mRNA的表达;培养上清中IL-10和TGF-β1水平利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测;tolDC,mDC和Th17细胞的百分含量采用流式细胞术检测;
　　结果:
　　1.临床标本HE染色病理学改变
　　对照组血管标本 HE染色为正常动脉,实验组血管标本 HE染色可见血管内皮隆起变形,内膜增厚,形成纤维粥样斑块;斑块处内皮下层大量纤维增生,其间可见散在平滑肌纤维和大量泡沫细胞;深部为大量空隙状或针样脂质沉积。
　　2.S-100+VDC的表达
　　免疫组化结果显示S-100在对照组中低表达而在实验组中高表达。
　　3.免疫原性VDC CD83、CD1a、CCR7的表达
　　免疫组织化学染色结果显示免疫原性CD83、CD1a、CCR7阳性VDC在实验组中大量表达;Western blot结果显示,与对照组相比,实验组CD83和CD1a蛋白的表达明显增高.
　　4.耐受性VDC CD11b、DC-SIGN、TLR-2和IDO的表达
　　免疫组化结果显示:耐受性CD11b、DC-SIGN、TLR-2和IDO阳性VDC在实验组中低表达,Western blot结果显示,与对照组相比,实验组CD11b和IDO蛋白的表达增多,且含量明显低于免疫原性VDC CD83和CD1a蛋白表达。
　　5.细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4体外能够成功诱导CD11c+CD11b+tolDC并显示耐受特性
　　5.1体外能够成功诱导CD11c+CD11b+tolDC
　　采用rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导,CD11c+CD11b+tolDC百分含量在45％,并采用流式细胞分选系统分离纯化得到的细胞纯度到达99%。每只小鼠能获得大约1×106个CD11c+CD11b+tolDC。
　　5.2 CD11c+CD11b+tolDC呈现耐受特性
　　rmGM-CSF和rmIL-4诱导的CD11c+CD11b+tolDC培养上清IL-10和TGF-β1水平较高,高于LPS诱导的mDCs培养上清IL-10和TGF-β1水平。提示GM-CSF和rmIL-4诱导的CD11c+CD11b+tolDC可通过分泌IL-10和TGF-β1而显示耐受潜能。
　　6.体外CD11c+CD11b+tolDC对Th17细胞的调节作用
　　6.1体外tolDC降低体外共培养Th17细胞的百分含量
　　PMA+Ion+BFA共同刺激T细胞48 h后,T细胞表达CD4+CD17+Th17细胞的百分含量明显增加,与tolDC共培养后,CD4+CD17+Th17细胞的百分含量明显降低。
　　6.2 tolDC体外降低共培养T细胞IL-17 mRNA的表达
　　PMA+Ion+BFA共同刺激T细胞48 h后,T细胞表达IL-17mRNA明显增加,与tolDC共培养后,T细胞表达IL-17mRNA的水平明显降低。
　　6.3 tolDC体外降低共培养上清IL-17的水平
　　PMA+Ion+BFA共同刺激T细胞48 h后,T细胞表达IL-17明显增加,与tolDC共培养后,T细胞表达IL-17的水平明显降低。
　　结论:
　　1.免疫原性及耐受性DC可能参与了AS的形成过程及炎症性免疫反应,免疫原性树突细胞可能促进了疾病的进展。
　　2.细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4体外能够成功诱导CD11c+CD11b+tolDC。
　　3.tolDC体外能抑制Th17细胞的功能。

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英文缩略词对照（Abbreviation）

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英文摘要

一、前 言

二、实验

实验一 树突细胞在动脉粥样硬化动脉壁内的分布

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4小结

实验二耐受性树突细胞对Th17细胞的调节作用

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4小结

三、讨论

1免疫原性和耐受性树突细胞两者在AS病变动脉壁内均有分布

2 血管免疫原性树突细胞可能参与了动脉粥样硬化的形成过程并且免疫原性树突细胞的增高可能参与了下肢动脉粥样硬化闭塞症的炎症性免疫反应

3细胞因子rmGM-CSF和 rmIL-4体外能够成功诱导tolDC

4 tolDC体外能抑制Th17细胞的功能

5 tolDC为临床应用DCs治疗AS疾病提供新思路

四、结论

1免疫原性和耐受性树突细胞两者在AS病变动脉壁内均有分布

2免疫原性血管树突细胞含量明显高于耐受性血管树突细胞，提示血管免疫原性树突细胞可能参与了动脉粥样硬化的形成过程并且免疫原性树突细胞的增高可能参与了动脉粥样硬化的炎症性免疫反应

3细胞因子rmGM-CSF和 rmIL-4体外能够成功诱导tolDC

4 tolDC体外能抑制Th17细胞的功能

5 tolDC为临床应用DCs治疗AS疾病提供新思路

参考文献

附录

致谢

综述

参考文献