Akt/mTOR/p70S6K通路在HSC-T6的活化增殖中的作用及栀子苷抗肝纤维化作用研究

摘要

肝纤维化(fibrosis of liver)实质是一种由多种原因病毒、代谢、药物、酒精、血吸虫等引起的慢性肝损伤的伤口愈合反应,它的主要表现是肝内细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)在狄氏间隙(Space of Disse)的肝窦内皮细胞层大量过度沉积及所导致的肝脏功能的损伤,是慢性肝病发展到肝硬化必经阶段。大量实验研究已经证实,活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是过度沉积的ECM的主要来源,而且HSC的活化是肝纤维化发生发展过程中的核心环节,通过抑制HSC活化增殖可以减缓肝纤维化的发生发展。
　　栀子是药食两用的传统中药,又称为黄栀子、山栀子,药用栀子是茜草科植物栀子的成熟果实,具有利胆、镇痛、抗炎等作用。栀子苷(geniposide),属于环烯醚萜类化合物,是栀子药效作用的主要有效成分,有研究表明,栀子苷具有利胆、保肝、抗炎等方面作用。本实验室前期研究结果表明,栀子苷具有肝脏保护作用,进一步研究发现,栀子苷能够抑制PDGF介导的HSC-T6细胞增殖活化,其具体作用机制可能与阻断了Akt/mTOR/p70S6K通路有关。
　　核糖体70S小亚基S6蛋白激酶(p70S6K)是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mamm--alian target of Rapamycin,mTOR)的下游底物,它是一种核糖体蛋白激酶,可以促进细胞的生长和增殖,研究表明,在癌症等疾病中,p70S6K活化水平明显升高,抑制其表达可明显抑制肿瘤细胞的增殖。鉴于p70S6K在细胞增殖中的重要作用,我们设想阻断p70S6K的活性可以抑制HSC的活化增殖。为验证这一设想,采用Western blot方法检测了磷酸化p70S6K在肝纤维化大鼠肝组织以及活化的HSC-T6中的表达水平,结果发现,在纤维化组织和活化的HSC-T6中,磷酸化p70S6K的表达水平都明显升高,提示,p70S6K有可能参与调节HSC的活化增殖,影响肝纤维化的发生发展。为进一步阐明p70S6K与HSC活化增殖之间的联系,本课题进行了以下研究。
　　1.磷酸化p70S6K在肝纤维化大鼠肝组织和活化的肝星状细胞系HSC-T6中的蛋白表达
　　SD大鼠灌胃给予CCl4,建立肝纤维化模型,Western blot检测磷酸化p70S6K、肝纤维化大鼠肝组织中的蛋白表达;PDGF(10 ng/ml)诱导HSC-T6细胞活化,Western blot检测磷酸化p70S6K在活化的HSC-T6细胞中的蛋白表达。实验结果发现,磷酸化p70S6K在纤维化的肝组织和活化的HSC-T6细胞中表达均升高了。
　　2.抑制p70S6K的活性对大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化增殖的影响
　　利用雷帕霉素(2,20,50ng/ml)预处理HSC-T6细胞2h后,再加PDGF(10ng/ml)作用24h或48h,运用MTT和流式细胞仪检测HSC-T6细胞增殖情况和细胞周期分布,Western blot和RT-PCR检测HSC-T6细胞磷酸化p70S6K、α-SMA和Collagen I的表达情况;利用LipofectamineTM2000将特异性p70S6K-siRNA转染到HSC-T6内,下调p70S6K的表达,降低其活性,运用MTT和流式细胞仪检测HSC-T6细胞增殖情况和细胞周期分布,Western blot和RT-PCR检测HSC-T6细胞磷酸化p70S6K、α-SMA和Collagen I的表达情况。实验结果发现,雷帕霉素和p70S6K-siRNA作用均降低了p70S6K的活性,抑制了HSC-T6的活化和增殖。
　　3.栀子苷单体对PDGF诱导的HSC-T6活化增殖的影响
　　不同浓度的栀子苷(20,50,100,200,400μg/ml)作用于HSC-T6细胞,MTT检测细胞活力,判断栀子苷的细胞毒性;用低、中、高浓度的栀子苷(20,50,100μg/ml)预处理HSC-T6细胞2h后,再加PDGF(10ng/ml)作用24h或48h,运用MTT检测细胞活力,Western blot检测HSC-T6细胞活化增殖MAPK通路蛋白ERK、p38活化水平以及Akt/mTOR/p70S6K通路蛋白活化水平的表达。实验结果发现,栀子苷抑制了HSC-T6的活化增殖,同时降低了Akt/mTOR/p70S6K通路蛋白活化水平,对ERK、p38活化水平无显著影响。

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前言

1 实验材料

1.1 实验动物和细胞

1.2 主要试剂

1.3 仪器与设备

1.4 溶液和试剂的配制

2 实验方法

2.1 CCl4诱导大鼠肝纤维化模型

2.2 病理学检测

2.3 HSC-T6细胞培养和传代

2.4 p70S6K-siRNA转染HSC-T6

2.5 MTT试验

2.7 Western Blot

2.9 细胞周期检测

2.9 统计学处理

3 结果

3.1在CCl4诱导的大鼠肝纤维化组织中p70S6K的磷酸化水平检测

3.2 磷酸化p70S6K在活化的HSC-T6中的表达水平

3.3雷帕霉素抑制p70S6K的活性对PDGF诱导的HSC-T6活化增殖的影响

3.4 p70S6K-siRNA转染HSC-T6对PDGF诱导的HSC-T6活化增殖的影响

3.5 栀子苷对HSC-T6细胞的毒性作用

3.6 栀子苷抑制PDGF诱导的HSC-T6细胞增殖

3.7 栀子苷抑制PDGF诱导的HSC-T6细胞活化

3.8 栀子苷对MAPK通路蛋白P-ERK、P-p38表达的影响

3.9 栀子苷对Akt/mTOR/p70S6K通路的影响

参考文献

附录

致谢

综述