下丘脑腹外侧视前区-结节乳头体核对大鼠睡眠-觉醒周期的调节作用及其受体途径研究

摘要

目的:
　　下丘脑腹外侧视前区（ventrolateral preoptic nucleus，VLPO）和结节乳头体核（tuberomammillary nucleus，TMN）分别是公认的促睡眠中枢和促觉醒中枢，两者以“此消彼长”相互制约的模式进行睡眠觉醒周期的调控。γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸是脑内参与睡眠觉醒调节的重要神经递质。为了进一步探究和阐述下丘脑腹外侧视前区-结节乳头体核调节睡眠觉醒周期的机制，本实验通过多导睡眠描记技术、脑立体定位微量注射技术、免疫组织化学等方法探讨VLPO-TMN对大鼠睡眠-觉醒周期的影响及其调节的受体通路。
　　方法:
　　1.动物分组：根据实验总体设计，大鼠用于三个部分：
　　1.1 多导睡眠描记与分析：大鼠随机分成对照组[VLPO和TMN内均微量注射人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF），即VLPO+ACSF& TMN+ACSF组]和实验组Ⅰ（VLPO微量注射 L-Glu同时TMN微量注射ACSF，即VLPO+L-Glu& TMN+ACSF组）、实验组Ⅱ（VLPO微量注射L-Glu同时TMN微量注射Bic，即VLPO+L-Glu& TMN+Bic组）。
　　1.2 检测VLPO区域代谢型谷氨酸受体以及TMN核团GABAA受体表达。
　　1.3 观察兴奋VLPO神经元后TMN区域c-Fos表达量的变化：大鼠随机分成对照组（VLPO微量注射ACSF，即VLPO+ACSF组）和实验组（VLPO微量注射L-Glu，即VLPO+L-Glu组）。
　　2.动物模型建立选取健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠，体重280-300g。手术前准备好所需试剂以及仪器设备。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后将其头部固定于脑立体定位仪上，暴露颅骨，根据大鼠脑定位图谱把两根不锈钢中空引导管插入VLPO（AP：-0.36mm；R：1.30mm；H：-7.00mm）及TMN（AP：-3.96mm；R：1.50mm；H：-7.70mm）用于核团内给药，用牙科粘固粉将中空引导管和记录电极固定于大鼠颅骨表面，再把引导脑电与肌电的电极用细铜线和微型插座相连接（上述操作步骤用于建立多导睡眠描记模型，观察大鼠c-Fos表达变化的大鼠模型建立只需向VLPO内插入一根不锈钢中空引导管用于微量给药，同时省去上述电极与微型插座的操作），然后给予大鼠一定剂量抗生素（青霉素），缝合创口，最后放入隔音室中饲养，保证饮水和食物充足，并随时观察大鼠恢复状况。
　　3.微量注射给药用Hamilton微量注射器通过中空引导管向目的核团VLPO/TMN注射药物或ACSF，注射速度为1?l/min，给药完成将注射器停留1min防止药液渗出。给药时间为22:00-22:20（睡眠描记）和20:00-20:20（c-Fos表达量变化观察）。
　　4.多导睡眠描记分析数据记录从给药前2小时（20:00）开始，记录时间为24小时。10秒为一个分段周期，将大鼠的睡眠觉醒周期分成：（1）觉醒期（wakefulness，W）；（2）快动眼睡眠期（rapid eye movement，REM）；（3）非快动眼睡眠期（non-rapid eye movement，NREM）；REM睡眠和NREM睡眠总和定为总睡眠时间（total sleep time，TST）。
　　5.取材大鼠经腹腔麻醉后，剪开胸腔并暴露心脏，持灌流针从心尖插入心脏经左心室至主动脉，迅速剪开右心耳，快速注入生理盐水约250ml，看到肝脏发白，再缓慢注入4％多聚甲醛约600ml，随后断头并用止血钳小心拨开颅骨取出脑组织。用刀片切成0.5cm左右厚度，最后放入4%多聚甲醛固定6h。
　　6.免疫组化检测将包含目的核团的蜡块切成厚度为4um的切片，烤片后用二甲苯脱蜡梯度酒精水化，使用免疫组化试剂盒进行受体染色，最后在显微镜下观察染色情况。
　　7.半定量分析TMN区域的c-Fos染色用累计光密度（integrated optical density，IOD）值反映蛋白表达水平。
　　8.统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准误（-x±s）表示，组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）以及t检验。检验水准P<0.05为差异具有统计学意义。
　　结果:
　　1. VLPO微量注射ACSF/L-Glu与TMN微量注射ACSF/Bic对大鼠脑电活动的影响
　　1.1 与对照组VLPO+ACSF& TMN+ACSF组（n=8）相比，VLPO+L-Glu&TMN+ACSF组（n=7）大鼠VLPO内微量注射L-Glu后从第二个小时起的两个小时内，其觉醒减少42.2%（38.13±3.17，P<0.01），非快动眼睡眠（NREM）与总睡眠时间（TST）分别增加了89.5%（52.90±2.98，P<0.01）、80.5%（69.33±3.63，P<0.01），快动眼睡眠（REM）无显著变化，差异无统计学意义；
　　1.2 与VLPO+L-Glu& TMN+ACSF组（n=7）相比，VLPO+L-Glu& TMN+Bic组（n=8）中GABA受体阻断剂Bic和L-Glu分别相继微量注射于TMN和VLPO，给药后的第二、三个小时内大鼠的觉醒量增加了81.1%（66.12±3.26，P<0.01），REM睡眠和NREM睡眠以及TST分别减少了58.9%（4.94±1.02,P<0.05）、50.2%（39.62±2.93,P<0.01）、56.1%（47.11±4.14,P<0.01）。
　　1.3 与VLPO+ACSF& TMN+ACSF组比较，VLPO+L-Glu& TMN+Bic组的大鼠睡眠觉醒状况未发生显著变化，差异无统计学意义。
　　2.免疫组化结果
　　2.1 mGluR5在 VLPO区域的表达与用PBS代替一抗的空白对照相比，mGluR5在VLPO区域阳性表达明显，呈现棕黄色的强染色，定位于胞质膜，核呈蓝色，细胞容易辨认，结构清晰，阳性对照表达良好。
　　2.2 GABAARβ1在 TMN区域的表达与用PBS代替一抗的空白对照相比，TMN区域的 GABAARβ1为棕色或棕黄色阳性表达，定位于细胞膜，核呈蓝色，细胞容易辨认，结构清晰，阳性对照表达良好。
　　3.激动VLPO后TMN区域c-Fos蛋白表达的变化与对照组（53.98±2.02）相比，在VLPO脑区微量注射L-Glu后，检测到大鼠的TMN区域c-Fos表达量（21.82±1.22）明显减少，IOD值差异有统计学意义，软件分析t=11.10（P<0.01）。
　　结论:
　　存在于VLPO和TMN的代谢型谷氨酸受体及γ-氨基丁酸受体介导VLPO-TMN的通路调节，VLPO可通过GABAAR抑制TMN神经元活动。

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1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

参考文献

附录个 人 简 历

致谢

综述: 睡眠觉醒系统与神经调节机制浅析