RNA干扰ERCC1基因表达对人卵巢癌耐药细胞DDP、PGPIPN敏感性的影响

摘要

实验一慢病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达载体的构建及其稳定转染细胞株的建立
　　目的：设计并构建人ERCC1基因shRNA慢病毒质粒表达载体，并建立人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP稳定转染细胞株，以探索治疗卵巢癌耐药的新方法。
　　方法：基因数据库搜索人ERCC1基因序列，并设计3条针对人ERCC1基因的siRNA序列，瞬时转染人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP，筛选出最有效沉默靶基因的siRNA后，针对其设计并合成能表达其小发卡结构的shRNA序列，与经BamH I和EcoR I进行双酶切的慢病毒载体质粒pLVX-shRNA1连接、转化，挑取筛选的单菌落，经PCR和测序鉴定后提取重组质粒，慢病毒重组质粒pLVX-shRNA1-ERCC1及慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共同转染包装细胞293T细胞，收获病毒上清，测定病毒滴度，转染SKOV-3/DDP细胞，利用嘌呤霉素筛选得到稳定转染pLVX-shRNA1-ERCC1的SKOV-3/DDP细胞株，最后利用RT-PCR鉴定干扰效果。
　　结果：PCR和测序鉴定结果证明双链shRNA成功插入慢病毒载体pLVX-shRNA1；共同转染293T细胞得到高滴度病毒，浓缩病毒滴度悬液滴度108IFU以上；转染SKOV3/DDP后获得稳定转染pLVX-shRNA1-ERCC1的SKOV-3/DDP细胞株；PCR鉴定检测到ERCC1 mRNA基因表达显著下降。
　　结论：应用RNA干扰技术，能够高效、特异的沉默ERCC1基因的表达，针对卵巢癌ERCC1的RNAi技术，可能成为卵巢癌耐药的临床治疗开拓一条新的途径。
　　实验二RNA干扰ERCC1基因表达对人卵巢癌耐药细胞DDP、PGPIPN敏感性的影响
　　目的：探讨RNA干扰核苷酸剪切修复偶联因子1(ERCC1)基因表达对人卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞DDP、PGPIPN敏感性的影响。
　　方法：通过前期体外设计、合成针对ERCC1基因的 RNA干扰双链DNA片段，并转染人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP,建立稳定转染pLVX-shRNA1-ERCC1的SKOV3/DDP细胞株和稳定转染pLVX-shRNA1-Negative control的SKOV3/DDP细胞株，将实验分为以下3组:空白对照组（人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP细胞）、特异性转染组（稳定转染pLVX-shRNA1-ERCC1的SKOV3/DDP细胞）和非特异性转染组（稳定转染pLVX-shRNA1-Negative control的SKOV3/DDP细胞）。采用MTT法测定PGPIPN、DDP对三组细胞的增殖抑制率，RT-PCR法检测PGPIPN对三组细胞乳腺癌易感基因1(BRCA1)基因表达的影响，Western blot法检测PGPIPN对BRCA1蛋白表达的影响。
　　结果：MTT法结果显示，PGPIPN作用人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP48 h，对其增殖具有一定的抑制作用，在浓度为40、60 mg/L时，与浓度为0 mg/L比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；DDP、PGPIPN分别作用特异性转染组细胞48 h，特异性转染组细胞的增殖明显受到抑制，与DDP、PGPIPN浓度分别为0 mg/L比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；RT-PCR法结果显示，PGPIPN作用特异性转染组细胞48 h，其BRCA1基因表达随着PGPIPN浓度升高而明显降低，在浓度为40、60 mg/L时，与PGPIPN浓度为0 mg/L比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。Western blot法结果显示，PGPIPN作用特异性转染组细胞48 h，其BRCA1蛋白表达随着PGPIPN浓度升高而明显降低，在浓度为60 mg/L时，与PGPIPN浓度为0 mg/L比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　结论：PGPIPN对SKOV3/DDP细胞的增殖具有一定的抑制作用，并且通过干扰 ERCC1基因表达可以明显增强SKOV3/DDP细胞对DDP、PGPIPN的敏感性，同时可增强PGPIPN对BRCA1基因及蛋白的下调水平。

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实验一 慢病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达载体的构建及其稳定转染细胞株的建立

中文摘要

Abstract

1前言

2 材料与方法

3结果

4 讨论

5 总结

参考文献

实验二 RNA干扰ERCC1基因表达对人卵巢癌耐药细胞DDP、PGPIPN敏感性的影响

中文摘要

Abstract

1前言

2、 材料与方法

3结果

4讨论

5总结

参考文献

简历

致谢

综述: RNA干扰在卵巢癌中的研究进展