非受体型酪氨酸激酶TEC在LPS诱导巨噬细胞促炎性细胞因子产生中的作用

摘要

一、研究背景：
　　脓毒症(sepsis)是感染、休克、严重创伤和外科大手术患者常见的并发症，可进一步发展为脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等，甚至死亡，是危重病患者的最主要死亡原因之一。脓毒症的本质是感染所引起的失控的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory responsesyndrome，SIRS)，通过各种炎症介质过度释放，引起广泛的自身细胞和组织损伤以及多器官功能障碍。近年来学术界对SIRS的机制已获得共识：SIRS是机体非特异性免疫系统（特别是单核－巨噬细胞）对细菌内毒素及其致炎物质的过度反应。
　　Tec(Tyrosine kinase expressed in hepatocelluar carcinoma)是1990年Mano等在研究肝癌时，在肝癌组织中筛选得到的、起重要作用的一种酪氨酸蛋白激酶基因。其是一种重要的非受体型蛋白酪氨酸激酶，存在于胞质内，主要在肝脏、T细胞、B细胞、造血细胞等中表达，主要与GM-CSF、EPO、EGF、IL-6等细胞因子介导的信号转导途径密切相关，参与对血细胞尤其是B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖与分化，并在肝细胞增殖中发挥着重要的调控作用。近几年国内外很多研究发现，它也参与一些类风湿性关节炎等慢性炎症相关性疾病的炎症反应过程。综上，Tec家族激酶可能与炎症过程有着密切的关系，且有一些重要问题未被阐明。
　　本实验采用RAW264.7单核巨噬细胞为研究对象,观察脓毒症时巨噬细胞TEC的表达及活化规律,并使用TEC激酶特异性抑制剂LFM-A13进行干预,观察TEC激酶在巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β产生中的作用,以了解TEC激酶在脓毒症时巨噬细胞炎症介质产生中的作用和机制,以进一步了解脓毒症的发生机制并为其防治提供新的思路和方法。
　　二、研究目的：
　　1.探讨LPS对RAW264.7巨噬细胞TEC激酶表达及TEC激酶磷酸化水平的影响。
　　2.研究TEC激酶在RAW264.7巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-a和IL-1β产生中的作用。
　　三、研究内容
　　第一部分LPS对RAW264.7巨噬细胞TEC激酶表达的影响
　　小鼠RAW264.7单核巨噬细胞常规培养后分剂量效应和时间效应两方面进行研究。(l)剂量效应研究:加入不同浓度的lps(0.01,0.1,1,10,100ug/ml)刺激24h。(2)时间效应研究:加入0.1ug/ml的lps分别刺激0,15min，30min，45min，60min和120min;采用Western Blot法联合免疫沉淀法检测细胞TEC激酶的表达和TEC激酶磷酸化水平。
　　第二部分TEC激酶在LPS诱导巨噬细胞促炎性细胞因子产生中的作用
　　按照随机数字表法将培养于6孔板的RAW264.7巨噬细胞分为4组，每组8孔细胞。包括：
　　（1）空白对照组:：采用含体积分数10％FBS的DMEM培养液常规培养2 h；
　　（2）LFM-A13组：预先用75μmol/L的TEC激酶特异性抑制剂LFM-A13预处理细胞1 h，再常规培养1 h；
　　（3）LPS组：采用含体积分数10%FBS的DMEM培养液常规培养1 h，再用0.1μg/mL LPS刺激1 h；
　　（4）LPS+LFM-A13组：预先用75μmol/L的LFM-A13处理细胞1 h，再用0.1μg/ml LPS刺激1 h。采用ELISA法测定各组培养上清液中TNF-α和IL-1β的含量；实时荧光定量PCR检测细胞内TNF-α和IL-1βmRNA的表达；蛋白印迹法检测细胞内TEC激酶、转化生长因子激活激酶（TAK1）和p38 MAPK的活性。
　　四、研究结果：
　　第一部分
　　Western Blot结果显示：
　　（1）LPS诱导RAW264.7单核巨噬细胞TEC激酶的表达表达呈剂量依赖性,在一定范围内(<1ug/ml),随LPS浓度的增加,巨噬细胞TEC激酶的表达逐渐增强,LPS为1ug/ml孵育24h时诱导TEC激酶表达达到高峰,但高浓度(>1ug/ml)时LPS的刺激效应逐渐降低。
　　（2）LPS(O.1ug/ml)诱导RAW264.7单核巨噬细胞TEC激酶磷酸化水平呈时间依赖性,孵育15min后,巨噬细胞TEC激酶磷酸化水平开始上升,在60min达到最高峰,随后下降。
　　第二部分
　　ELISA、Real-time PCR和Western Blot结果显示：LFM-A13组培养上清液中的TNF-α、IL-1β含量分别为329±41、220±27，与空白对照组的330±44、211±31接近（P值均大于0.05）；其TNF-α、IL-1βmRNA含量分别为0.92±0.13、0.98±0.13，与空白对照组的1.00±0.18、1.00±0.19接近（P值均大于0.05）。LPS组细胞培养上清液中的TNF-α、IL-1β含量分别为（1213±154）、（636±90）pg/mL，均显著高于空白对照组（P值均小于0.01）；其细胞内的TNF-α和IL-1β mRNA表达分别为1.57±0.22、1.44±0.24，均显著高于空白对照组（P值均小于0.01）。LPS+LFM-A13组上清液中的TNF-α、IL-1β含量分别为（787±109）、（453±64）pg/mL，显著低于LPS组（P值均小于0.05）；其细胞内TNF-α和IL-1βmRNA表达分别为1.21±0.15、1.21±0.22，也显著低于LPS组（P值均小于0.05）。LPS组细胞内TEC、TAK1和p38 MAPK活性表达分别为2.69±0.41、3.99±0.65、2.07±0.31，均明显高于空白对照组的1.00±0.17、1.00±0.16、1.00±0.18（P值均小于0.01）；LPS+LFM-A13组细胞内TEC、TAK1和p38 MAPK活性表达（分别为1.02±0.17、1.18±0.20、1.58±0.28）亦较LPS组显著下降（P<0.05或P<0.01）。
　　五、研究结论：
　　1.LPS可以诱导RAW264.7单核巨噬细胞TEC激酶的表达，且与LPS呈剂量依赖关系；TEC激酶磷酸化水平变化和LPS呈时间依赖关系。
　　2.TEC激酶通过TAK1-P38 MAPK信号通路介导了LPS诱导RAW264.7巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生和释放。

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前言

第一部分LPS对RAW264.7巨噬细胞非受体型酪氨酸激酶TEC表达的影响

1.材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分TEC激酶在LPS诱导巨噬细胞促炎性细胞因子产生中的作用

1.材料和方法

2. 结果

3.讨论

参考文献

全文小结

附录

致谢

综述: TEC酪氨酸激酶在脓毒症炎症反应中作用的研究进展