HDND-7对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的治疗作用及部分作用机制研究

摘要

肝纤维化（liver fibrosis)的本质是一种由病毒、药物、代谢及酒精等多种原因引起的慢性肝损伤的伤口愈合反应，它的主要特征是肝内细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)大量过度沉积。研究表明，过度沉积的 ECM的主要来源是活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)，而HSC的增殖活化则是肝纤维化发生发展过程中的中心事件，可受到多条信号通路及细胞因子的影响。通过抑制HSC活化和增殖可以有效的减缓肝纤维化的发生发展和治疗肝纤维化。
　　大量研究表明中药在肝纤维化的预防和治疗中起着重要的作用。橙皮素（Hesperitin）是一类天然黄酮类化合物，来源于芸香科柑橘属果实的果皮，是其主要的药效活性成分之一。有文献显示，橙皮素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等生物活性。但由于水溶性差和生物利用度低等问题限制了临床应用。因此本实验室前期合成改进了一系列的橙皮素衍生物，并且筛选这些衍生物是否对肝纤维化有作用。橙皮素衍生物7（HDND-7）是系列筛选的化合物之一，对PDGF诱导的HSC-T6细胞增殖活化有明显的抑制作用，提示有进一步研究与开发的前景。
　　文献报道，wnt信号通路在各种细胞生理过程中发挥着重要作用，如细胞的生长、增殖和凋亡。此外，wnt信号通路的一些成分被报道参与伤口愈合和纤维化，并且在 HSC衍生的成纤维细胞中表达上调。wnt信号通路中的经典的Wnt/β-catenin信号通路在维持肝星状细胞的静止状态中发挥着重要作用，并且广泛参与各种肿瘤的增殖，如肝癌、肺癌、膀胱癌等。鉴于Wnt/β-catenin信号通路在细胞活化和增殖中的重要作用，提示HDND-7的抗纤维化作用可能是通过阻断Wnt/β-catenin信号通路实现的。为了验证这一设想，本课题进行了以下研究。
　　1. HDND-7对小鼠肝纤维化的作用
　　昆明小鼠腹腔注射CCl4，建立肝纤维化模型，HE、Masson染色及免疫组化检测各组纤维化组织的损伤程度；用HE和Masson染色及免疫组化进行肝组织的病理学组织检查；ALT、AST和HA试剂盒检测肝损伤指标ALT、AST和肝纤维化指标HA；用Western blot和RT-PCR检测α-SMA，collagen I，β-catenin，cyclind1 and c-myc在肝纤维化小鼠肝组织中的mRNA和蛋白表达水平。实验结果发现，HDND-7对CCl4诱导的小鼠肝纤维化具有一定的治疗作用。
　　2. HDND-7对大鼠肝星状细胞的活化和增殖的影响
　　用MTT法检测不同浓度的HDND-7(10，50，100，200μM)对HSC-T6细胞的细胞活力的影响，从而判断 HDND-7对 HSC-T6细胞的细胞毒性；用PDGF(10 ng/ml)预处理HSC-T6细胞2 h后，再加低、中、高浓度的HDND-7(10，50，100μM)作用细胞24 h或48 h，采取MTT方法和流式细胞术来检测大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖和凋亡情况以及细胞周期分布。Western blot和RT-PCR检测HSC-T6细胞α-SMA、Collagen I、β-catenin、cyclind1和c-myc的表达水平。最终的实验结果表明，HDND-7能够明显抑制HSC-T6的活化和增殖。
　　3. HDND-7对经典的Wnt/β-catenin信号通路的作用
　　PDGF(10 ng/ml)预处理HSC-T6细胞2h后，加入HDND-7(10，50，100μM)作用24 h或48 h，Western blot和RT-PCR检测HSC-T6细胞β-catenin、cyclind1和c-myc的表达情况；利用PDGF(10 ng/ml)及icRT3(60ng/ml))预处理HSC-T6细胞2h，再加HDND-7(10，50，100μM)作用24 h或48 h，Western blot和RT-PCR检测HSC-T6细胞α-SMA、β-catenin、cyclind1和c-myc的表达情况。实验结果提示，HDND-7能抑制Wnt/β-catenin信号通路并部分通过Wnt/β-catenin信号通路来抑制HSC-T6的活化增殖。

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前言

1 实验材料

1.1 实验动物和细胞

1.2 主要药品和试剂

1.3 仪器与设备

1.4 图象分析软件

2 实验方法

2.1 建立小鼠肝纤维化模型

2.2 病理学检测

2.3 HSC-T6细胞培养和传代

2.4 MTT试验

2.5 PCR

2.6 Western Blot

2.7 细胞周期检测

2.8 统计学处理

3 结果

3.1 HDND-7对CCl4诱导的肝纤维化小鼠的治疗作用

3.2 HDND-7对HSC-T6细胞的作用

4 讨论

5结论

参考文献

附录

致谢

综述