干扰TPD52基因表达对胶质瘤细胞的影响及miRNA-34a通过靶向TPD52调节胶质瘤细胞的周期变化

摘要

研究目的：
　　（1）探究TPD52基因在胶质瘤组织、正常脑组织及U87细胞中的表达水平；（2）探究干扰TPD52基因表达后对胶质瘤U87细胞增殖、周期及凋亡的影响；（3）探究干扰TPD52基因表达后对胶质瘤U87侵袭、迁移的影响；
　　（4）探究miRNA-34a在胶质瘤组织及U87细胞中的表达水平；（5）探究miRNA-34a对胶质瘤细胞细胞周期的调节作用；
　　（6）探究miRNA-34a通过靶向TPD52调节胶质瘤U87细胞的周期变化。研究方法：
　　（1）收集我院12例胶质瘤患者病例标本，12例脑外伤患者正常脑组织病理标本，应用荧光定量PCR检测TPD52 mRNA的表达量，应用Western blot检测TPD52蛋白的表达量。应用荧光定量PCR检测miRNA-34a的表达量。
　　（2）将携带着shRNA-tpd52（抑制tpd52的核苷酸序列）、shRNA-NC（阴性对照的核苷酸序列）的慢病毒体外转染胶质瘤细胞系U87。在转染48 h后荧光显微镜下观察表达GFP细胞数量，采用荧光定量PCR、Western blot分别检测TPD52 mRNA及蛋白表达量，MTT检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期分布，AnnexinV和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell实验检测细胞侵袭能力。
　　（3）将miRNA34a模拟物及miRNA-34a抑制物转染入U87细胞，并用荧光定量PCR检测转然后细胞 miRNA-34a的表达水平。查阅相关文献并使用生物信息网分析预测TPD52的3，UTR是miRNA-34a的作用靶点，采用荧光素酶报告实验检验TPD52是否为miRNA-34a的靶基因。U87细胞经不同因素处理后，采用荧光定量PCR检测TPD52及相关蛋白的mRNA表达水平；采用Western blot实验检测TPD52及相关蛋白的蛋白表达水平；利用流式细胞仪检测U87细胞的细胞周期。
　　研究结果：
　　（1）荧光定量 PCR检测结果显示 tpd52mRNA在Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤组织（ΔCT0.73±0.47）、U87细胞（ΔCT0.74±0.32）中的表达水平明显高于正常脑组织（ΔCT1.92±0.42）(P<0.05)；而U87细胞与Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤组织中tpd52mRNA表达水平差异无统计学意义。Western blot检测结果显示TPD52蛋白表达量在在Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤组织、U87细胞中的表达水平明显高于正常脑组织的表达水平。（2）U87细胞慢病毒转染率通过携带的GFP表达来评估，通过在荧光显微镜下细胞计数得出细胞转染率>90%。与 shRNA-NC组及空白对照组相比较，shRNA-tpd52组细胞TPD52 mRNA及蛋白表达量明显减少(P<0.01)，而且细胞增殖能力明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；细胞周期被阻滞在G0/G1期、细胞凋亡比例明显增加（P<0.05），细胞迁移能力明显下降差异有统计学意义（P<0.05）；细胞侵袭能力明显下降差异有统计学意义（P<0.05）。
　　（3）荧光定量 PCR检测结果显示 miRNA-34a在Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤组织（ΔCT3.26±0.24）、U87细胞（ΔCT3.45±0.12）中的表达水平明显低于正常脑组织（ΔCT1.94±0.40）(P<0.05)；而U87细胞与Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤组织中miRNA-34a表达水平差异无统计学意义。
　　（4）经转染后的U87细胞，经周期实验发现转染miRNA-34a模拟物可明显使U87细胞停留在S期的细胞数量比例明显减少为16.12%，P<0.05，而转染miRNA-34a抑制物可明显使 U87细胞停留在 S期的细胞数量比例明显增加为43.56%, P<0.05。双荧光素酶报告基因实验发现转染 miRNA-34a模拟物可明显使 U87细胞中TPD52的3，UTR活性明显降低为32%，P<0.05，而转染miRNA-34a抑制物可明显使U87细胞中TPD52的3，UTR活性明显升高为58%，P<0.05。结论：
　　（1）TPD52在胶质瘤组织中表达水平比正常脑组织中较高。
　　（2）干扰TPD52基因表达，可抑制胶质瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡、阻滞细胞周期。
　　（3）干扰TPD52基因表达，可抑制胶质瘤细胞迁移能力及侵袭能力。
　　（4）miRNA-34a在胶质瘤组织中表达水平比正常脑组织中较低。
　　（5） miRNA-34a可以调节胶质瘤细胞的细胞周期，抑制胶质瘤细胞S期细胞比例。
　　（6） miRNA-34a具有直接靶向TPD52调节胶质瘤细胞的周期变化。

目录

声明

中英文缩略词表

1引言

实验一 干扰TPD52基因表达对胶质瘤细胞的影响

2材料与方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

实验二 miRNA-34a通过靶向TPD52调节胶质瘤U87细胞的周期变化

2材料与方法

3 结果

4.讨论

5参考文献

附录

致谢

综述:胶质瘤的基因靶向治疗现状