雄激素受体(AR)上调RNA结合蛋白QKI在去势抵抗性前列腺癌中的作用

摘要

背景：在我国，前列腺癌占所有男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第3位。前列腺癌发病隐匿，早期多无典型症状，当被发现时大多已是晚期。使前列腺癌的早期预防和诊断显得尤为困难。前列腺癌的早期诊断主要是根据血清中PSA的含量，直肠指诊也是一个主要的辅助手段。前列腺癌内分泌治疗效果显著，但是经过12-18月的雄激素剥夺治疗后，多数病人会不可避免地转变为去势抵抗性前列腺癌（Castration Resistant Prostate Cancer，CRPC）。去势抵抗性前列腺癌预后差，患者生活质量严重下降，给患者带来了十分严重的后果。因此，明晰去势抵抗性前列腺癌发生发展机制，有可能为前列腺癌的临床治疗提供新的方法。雄激素受体在去势抵抗性前列腺癌发生发展过程中发挥着十分重要的作用。目前，CRPC治疗的靶点均集中在AR调控上游，而从CRPC的发生机制来看，仅仅对AR通路上游的抑制，并不能阻止AR对下游基因的过度活化。因此，从AR信号通路下游着手，或可探寻增敏 CRPC细胞的潜在治疗靶点。　　QKI（quaking）是属于STAR（signal transduction and activation of RNA）家族的一种RNA结合蛋白，在神经系统发育过程中参与髓鞘发育。QKI基因不同突变体小鼠可以表现在出生前死于心血管肌肉系统发育障碍，或于出生后10天表现为快速的震颤以及到了成年强直性惊厥的发作而得名。除了在神经系统中对于髓鞘的形成发挥重要功能以外，QKI蛋白还参与了细胞的大多数生物学过程，比如血管发生、细胞凋亡、细胞黏附、细胞生长及形态形成和器官发生等。目前研究发现，QKI可能调控多达1430个下游靶基因，而其中有24％的基因参与细胞的增殖、转移，高度提示QKI可能在肿瘤的增殖与转移中发挥作用。AR与QKI之间是否存在调控关系，如果存在调控关系，那么对前列腺癌的发生发展有什么的作用目前尚未见到相关的文献报道。因此，明确二者之间的调控关系以及对前列腺癌的影响将有助于进一步理解前列腺癌的演变情况，也有助于提供新的治疗策略。　　目的：　　1、了解不同前列腺癌细胞系以及临床肿瘤组织样本中AR和QKI的分子和蛋白表达水平，明确二者是否有潜在的调控关系存在。　　2、观察表达内源性AR的前列腺癌细胞系在ADT干预情况下，前列腺癌细胞中AR和QKI的表达变化，以及CRPC细胞中AR突变体的变化情况。　　3、明确沉默AR对QKI表达的影响，以及对不同前列腺癌细胞周期和凋亡功能的影响。　　4、明确沉默QKI对AR表达是否存在影响，以及对细胞周期和功能的影响，初步探讨存在影响可能的机制。　　5、探究沉默QKI能否影响CRPC对抗雄药物比卡鲁胺的敏感性。　　方法和结果：　　1、提取临床肿瘤组织样本中的蛋白以及不同前列腺癌细胞系中的蛋白和分子，分别通过qRT-PCR和western blotting观察不同前列腺癌细胞系中AR和QKI的mRN A和蛋白表达。我们发现在AR高表达的肿瘤组织样本以及前列腺癌细胞系中，QKI的表达也明显增高。这表明AR也许能够调控QKI的表达。通过对QKI启动子区转录因子预测发现，可能有AR潜在的结合位点。通过双荧光素酶报告基因系统对QKI启动子区结合位点分析，存在AR的结合位点，而且AR能够正向调控QKI的活性。因此，AR可以正向调控QKI的表达。　　2、碳吸附血清培养前列腺癌细胞以排除其它激素和细胞因子对AR的活化作用。我们采用碳吸附血清和生理浓度二氢睾酮来验证雄激素对AR活化的调控。分别通过qRT-PCR和western blotting来观察不同前列腺癌细胞系中AR和QKI的mRNA和蛋白表达。通过qRT-PCR来观察AR突变体以及靶基因在去雄条件下的表达变化。发现在ADT情况下，前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2细胞中的AR和QKI表达均下降，加入二氢睾酮后培养，AR和QKI的表达有一定程度的恢复。进一步验证了AR能够正向调控QKI的表达。通过对C4-2中AR突变体及靶基因的检测发现，突变体分子表达水平出现了与此相反的变化。表明在去势抵抗性前列腺癌细胞中，AR突变体能够在没有雄激素存在的情况下自我活化，从而有利于细胞的存活。　　3、通过siRNA片段以及脂质体2000细胞转染来沉默 AR的表达，分别通过qRT-PCR和western blotting来检测细胞中AR、QKI和PSA的mRNA和蛋白表达。通过流式细胞术来检测沉默AR对前列腺癌细胞周期和凋亡功能的影响。发现沉默AR后QKI的蛋白和分子表达水平均下降，细胞发生周期阻滞，细胞凋亡增加。在细胞周期阻滞上，LNCaP和C4-2细胞表现不同，前者主要是发生了G1/S期阻滞，后者为G2/M阻滞。UBE2c是G2/M的主要调控分子，C4-2中该基因表达明显增高，这可能是C4-2发生G2/M阻滞的原因。　　4、通过siRNA片段以及脂质体2000细胞转染来沉默QKI的表达，分别通过qRT-PCR和western blotting来检测细胞中AR、QKI、PSA和HSP90的mRNA和蛋白表达。通过流式细胞术来检测沉默QKI对前列腺癌细胞周期和凋亡功能的影响。发现沉默AR后QKI的蛋白和分子表达水平均下降，HSP90分子表达水平明显下降。两株细胞均发生周期阻滞，细胞凋亡增加。在细胞周期阻滞上，LNCaP和C4-2细胞表现不同，前者主要是发生了G1/S期阻滞，后者为G2/M阻滞。此外还检测了内质网凋亡蛋白caspase-12以及G1/S期蛋白P27，G2/M期蛋白P21。结果表明，凋亡蛋白和周期蛋白均明显增高。　　5、通过MTT来检测细胞增殖功能。发现沉默了QKI后，CRPC细胞对抗雄药物比卡鲁胺的敏感性增加。　　结论：　　1、QKI的表达与AR表达密切相关，随AR的表达升高而增加。　　2、AR能够正向调控QKI的表达。　　3、沉默AR和QKI均使LNCaP细胞阻滞于G1/S期，C4-2细胞阻滞于G2/M期；同时均增加细胞凋亡。　　4、沉默QKI能增加CRPC细胞对比卡鲁胺的药物敏感性。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

一、雄激素非依赖性前列腺癌及其发生机制

二、AR及其功能调控

三、R N A结合蛋白QKI及其功能

第一部分 AR和QK I在不同前列腺癌细胞系以及肿瘤组织样本中的表达变化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 AR正向调控QK I对前列腺癌生物学功能的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4.讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢