感染早期HIV毒力对MSM人群HIV感染者疾病进展影响的研究

摘要

目的：　　由人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus， HIV）感染引起的疾病称为获得性免疫缺陷综合症，又称艾滋病。该病自1981年在美国首次发现以来，全球感染人数不断上升，蔓延范围越来越广，至今尚无有效的治疗方法，已成为全球人类最棘手的疾病之一。感染HIV后若不加以治疗，结局通常都是死亡;然而，不同感染者从感染到死亡的时间差异很大:有的不到一年，有的却超过二十年。导致HIV感染疾病进展差异的原因，目前仍然没有一个明确的结论。揭示该原因可能会对了解和控制艾滋病提供线索。　　研究显示HIV感染者不同疾病进展速率受多种因素的影响，主要包括病毒因素和宿主因素两个方面。Herbeck等通过Meta分析发现HIV流行30年内，感染者疾病进展加快，指出感染者疾病进展加快与HIV进化导致毒力增强相关。该推论尚有待实验研究验证。　　病原微生物致病力的强弱程度称为毒力。HIV毒力是指病毒对宿主细胞吸附、侵入、在细胞内生长和增殖以及造成宿主免疫损伤等一系列能力的总和。病毒感染能力和复制能力都是反映HIV毒力的指标。大量研究表明，基线CD4+T细胞数与感染者疾病进展密切相关，目前关于感染早期HIV毒力与疾病进展相关性研究较少。Hiroshi等对从疾病进展快的HIV B亚型感染者体内分离到的多重耐药毒株进行研究，发现其HIV感染能力、复制能力均高于其他多重耐药毒株和野生对照毒株。Julia G等对儿童HIVC亚型感染者血浆原代分离株进行了研究，发现缓慢进展者感染早期/停药一年后HIV分离株的复制能力明显低于典型进展者。目前CRF01-AE亚型HIV毒力与感染者疾病进展相关性研究未见报道。　　男男性接触人群已经成为我国艾滋病流行中一个新的快速增长人群，以CRF01-AE亚型感染为主。本实验室前期研究发现MSM人群HIV感染者进展至AIDS期的时间要远远短于国外与国内献血、吸毒人群，快速进展者比例高。但是，MSM人群中有一小部分感染者疾病进展缓慢。导致MSM人群CRF01-AE亚型HIV感染者疾病进展不同的病毒学因素尚未明确。　　从感染者体内获得的HIV原代分离株是具有感染性的HIV病毒颗粒，文献报道单个核细胞来源HIV分离株与血浆病毒克隆序列具有很高的遗传同源性。本研究以我国MSM人群CRF01-AE亚型HIV感染者单个核细胞来源原代分离株为研究对象，比较HIV分离株与血浆病毒env、gag区克隆序列基因多样性，检测感染早期HIV感染者体外病毒毒力，对毒力高低组感染者进行生存分析，研究感染早期毒力对MSM人群HIV感染疾病进展的影响，探讨MSM人群HIV感染者疾病进展不同的病毒学因素。　　方法：　　一、研究对象　　研究对象来自中国医科大学附属第一医院MSM高危人群随访队列，从2008年开始至今，每月或每3个月对队列人群定期随访。选取感染早期HIV新发感染者标本。根据疾病进程分为疾病快速进展者（Rapid progressors，RP）组和疾病典型进展者(Typical progressors，TP)组。分组标准为:RP，感染1年内CD4+T细胞绝对计数低于350 cells/μl。TP，感染1年内CD4+T细胞绝对计数始终高于500 cells/μl或感染3年内CD4+T细胞绝对计数始终高于350 cells/μl。通过PBMC共培养方法分离HIV，p24复制峰值＞10ng/ml。按上述筛选标准，共选取22例HIV新发感染者基线点病毒分离株，其中RP组11例，TP组11例。　　二、实验方法　　（一）CD4+T淋巴细胞测定　　20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl,室温避光15min，用FACS MMLTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。　　（二）病毒载量测定　　以200μl血浆采用标准模板制备法提取RNA，采用Roche公司HIV Monitor1.5 commercial kit在COBASAMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为50-1×107copies/ml。　　（三）正常人PBMC提取及CD8+T细胞分选　　采集正常人EDTA抗凝静脉血，应Ficoll淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，提取PBMC。取正常人PBMC，采用STEMCELL公司EasySepTM Human CD8Positive Selection Kit试剂盒分选CD8+T细胞，去CD8 PBMC用于病毒扩增实验。　　（四）HIV分离株扩增　　本扩增实验使用同一批去CD8正常人PBMC，以保证体外实验均一性。取10ng病毒株感染5×106植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA）刺激后去CD8正常人PBMC2.5h，加5ml培养液调整浓度至1×106/ml，置于37℃，5％CO2培养箱。每周补充PHA刺激后正常人PBMC;每3～4天收集培养上清并补充培养基。ELISA法定量测定p24抗原含量，绘制病毒生长曲线。p24抗原大于10ng即扩增阳性，收集病毒液培养阳性上清，-156℃深低温冰箱保存备用。　　（五）p24抗原检测　　使用旷博公司HIV p24抗原定量检测试剂盒(ELISA)检测培养上清，根据试剂盒说明书进行操作。　　（六）血浆病毒与分离株序列分析　　1、病毒RNA提取　　2、逆转录cDNA　　3、PCR扩增　　4、PCR产物纯化　　5、目的DNA与pMDTM18-T载体连接　　6、感受态大肠杆菌的制备　　7、连接产物的转化　　8、阳性克隆的筛选　　9、质粒小提　　10、核酸序列测定和序列结果分析　　11、基因距离计算　　（七）HIV分离株感染能力检测（TZM-bl细胞系）　　使用TZM-bl细胞系检测HIV分离株半数组织培养感染剂量(50％ tissueculture infectious dose，TCID50)。具体操作如下:取病毒液在96孔培养板中做4倍系列稀释，共设7个倍比稀释度(4-3～4-9)，重复四次。调整TZM-bl细胞系细胞浓度至0.1×106/ml，取50μl至上述各孔中。48h后，吸出150μl上清液，加入100μl荧光素酶染料，取150μl至96孔黑板，于96微孔板型多功能检测仪检测读数，Speaman-Karber公式计算TCID50。　　（八）HIV分离株感染能力检测（Ghost CCR5细胞系）　　使用Ghost CCR5细胞系检测HIV分离株单轮感染力。取2500pg毒株感染4×104 Ghost CCR5细胞（感染复数＞0.02），重复2次。调整体系总体积为300μl/孔。22℃，15009离心3h，置于37℃5％CO2培养箱。24h后收获细胞，使用流式细胞仪检测GFP表达百分率。　　（九）HIV分离株复制能力检测　　本复制能力检测实验使用同一批去CD8正常人PBMC，以保证体外实验均一性。PHA（终浓度5μg/ml）预刺激PBMC3天。取2000 TCID50毒株感染2×106去CD8正常人PBMC4h（感染复数为0.001），重复2次。PBS300g离心10min洗两次，移入24孔培养板，37℃5％CO2培养箱培养。每周补充PHA刺激后正常人PBMC;每周一、三、五收集培养上清并补充培养基。ELISA法定量测定p24抗原含量，绘制病毒生长曲线。　　（十）统计学处理　　采用SPSS18.0软件分析，首先对数据进行正态性检验，对P＞0.05总体分布符合正态分布的资料两样本均数比较采用t检验;对P＜0.05不符合正态分布的资料采用Mann-Whitney非参数检验;样本构成比分析采用卡方检验;生存分析采用Kaplan-Meier曲线（K-M曲线）计算生存率， Wilcoxon检验进行生存率的比较。统计概率采用双侧检验，P＜0.05时有统计学意义。　　结果：　　一、HIV原代分离株扩增阳性病例基本信息　　扩增结果阳性标准为p24抗原＞10ng/ml。标本阳性共22例，其中RP组11例，TP组11例。　　实验对象均为CRF01-AE亚型。RP组感染时间与TP组无显著性差别(P＞0.05)。RP组基线CD4+T细胞显著低于TP组(P＜0.0001);RP组基线病毒载量与TP组无显著性差别。RP组调定点CD4+T细胞显著低于TP组; RP组调定点病毒载量显著高于TP组(P=0.009);RP组1年点CD4+T细胞显著低于TP组(P＜0.0001);RP组1年点病毒载量显著高于TP组(P=0.005)。　　二、HIV分离株与血浆病毒系统进化树基因多样性分析　　对同时具有HIV分离株和血浆病毒标本的gag区（8例）和env区（4例）分别进行系统进化树基因多样性分析。结果显示HIV分离株与血浆病毒序列一致或者非常接近（Bootstrap≥85％），具有遗传同源性。　　三、感染早期TP组与RP组感染能力比较　　RP组与TP组感染滴度无显著性差异(P＞0.05)。本研究中22例毒株均为CCR5嗜性，可采用CCR5细胞系检测毒株单轮感染力，RP组平均GFP阳性细胞百分数高于TP组，但无统计学意义(P＞0.05)。　　四、感染早期TP组与RP组复制能力比较　　RP组分离株复制曲线p24峰值中位数对数为3.94pg/ml; TP组分离株复制曲线p24峰值中位数对数为3.49pg/ml。RP组分离株复制能力显著高于TP组(P=0.041)。　　五、感染早期HIV复制能力与感染者基线、调定点、1年点CD4+T细胞数和病毒载量相关性分析　　感染早期病毒复制能力与基线CD4+T细胞数呈显著负相关(P=0.006)，与基线病毒载量不相关(P＞0.05);感染早期病毒复制能力与调定点CD4+T细胞数呈显著负相关(P=0.049)，与调定点病毒载量呈正相关趋势，但无统计学意义(P＞0.05);感染早期病毒复制能力与感染者1年点CD4+T细胞数呈显著负相关(P=0.036)，与1年点病毒载量呈正相关趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。　　六、复制能力高组和低组疾病进展快慢人数构成比比较　　22例标本根据病毒复制曲线p24峰值中位数分为两组，即复制高组(＞Medianpeak p24)和复制低组(＜Median peak p24)。卡方检验结果显示RP组标本在复制高组分布显著高于复制低组(P＜0.05);而TP组标本在复制低组分布显著高于复制高组(P＜0.05)。　　七、复制能力高组和低组感染者生存分析　　以CD4+T细胞数＜350cells/μl作为随访终点，对复制能力高组和低组进行Kaplan-Meier生存分析，采用Wilcoxon进行两组生存率的比较。结果显示复制能力高组HIV感染者中位生存时间为93天，平均生存时间为147.18天;复制能力低组HIV感染者中位生存时间为1356天，平均生存时间为1388.27天。复制能力高组HIV感染者生存时间显著短于复制能力低组(P＜0.0001)。　　结论：　　1、MSM人群CRF-01AE亚型HIV原发感染者感染早期快速进展者病毒感染能力与典型进展者无显著差异，复制能力显著高于典型进展者　　2、MSM人群CRF-01AE亚型HIV原发感染者感染早期病毒复制能力与感染者基线、调定点、1年点CD4+T细胞数呈显著负相关　　3、MSM人群CRF-01AE亚型HIV原发感染者感染早期病毒复制能力高组中快速进展者构成比显著高于复制能力低组，复制能力高组生存时间显著短于复制能力低组

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 HIV毒力的相关研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介