CBL调节死亡受体在脂筏内重新分布参与奥沙利铂增强TRAIL诱导胃癌细胞凋亡

摘要

目的： 胃癌是世界范围内最常发生的恶性肿瘤之一，在亚洲国家是肿瘤死亡的主要原因。多数患者在诊断时已经是进展期或发生转移，5年生存率只有10％—15％。化疗是治疗晚期胃癌的主要手段。尽管化疗药物的应用使晚期病人的生存期有所延长，但中位总生存时间很难超过12个月。生物治疗有选择性治疗恶性肿瘤的潜力，因此具有很好的治疗前景。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子家族的成员之一。在体外研究中，TRAIL诱导许多肿瘤细胞的凋亡，对多数正常细胞没有毒性。但胃癌细胞对TRAIL相对不敏感。 TRAIL诱导的凋亡信号传递需要结合死亡受体4(DR4)和死亡受体5(DR5)。TRAIL与DR4和DR5结合后导致受体聚集，并募集Fas相关蛋白死亡结构域(FADD)和前caspase—8、前caspase—10，共同形成死亡诱导信号复合物(DISC)。DISC的形成促发下游效应物caspase并诱导凋亡。脂筏能为死亡受体聚集提供膜交换平台。最近的研究表明脂筏在启动死亡信号转导时发挥了重要作用。这些结果提示脂筏功能的失调也许是胃癌对TRAIL不敏感的原因之一。 某些化疗药物，比如表阿霉素、紫杉醇、顺铂，能够增强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。奥沙利铂是第三代含铂药物，奥沙利铂为基础的化疗方案对胃癌的疗效优于顺铂为基础的方案。有研究报道顺铂通过促进脂筏聚集增强了结肠癌细胞对Fas配体的敏感性。是否奥沙利铂能通过调节脂筏从而增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性还不清楚。 脂筏的功能受多种因素的调节。泛素连接酶Cbl家族是重要的调节因素。Cbl蛋白包括3个同源体，c—Cbl，Cbl—b和Cbl—3。c—Cbl和Cbl—b有相似的结构和功能。有研究报告c—Cbl和Cbl—b能够从T细胞和肥大细胞的脂筏中清除信号分子，导致脂筏无效聚集。此外，T细胞Cbl—b的缺失能促进抗原诱导的受体聚集和脂筏聚集。但是c—Cbl和Cbl—b是否能调节胃癌细胞的脂筏，并因此影响胃癌细胞对TRAIL的敏感性尚不明确。 为增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性，我们将奥沙利铂和TRAIL联合应用。本实验以人胃癌细胞株MGC803，BGC823，SGC7901为模型，对脂筏在奥沙利铂和TRAIL联合诱导细胞凋亡过程中的作用进行了研究，同时对脂筏聚集的调节因子c—Cbl和Cbl—b在此过程中的调控机制进行了初步探讨。 材料与方法： 1、采用MTT法测定细胞活力。 2、采用流式细胞仪通过PI—Annexin V染色进行细胞凋亡判定。 3、采用流式细胞仪通过DiOC6染色进行线粒体跨膜电位测定。 4、采用Western blot检测c—Cbl，Cbl—b，caspase—3，caspase—8，Bax，Bcl—2蛋白的表达。 5、采用免疫荧光显微技术观察细胞膜脂筏和死亡受体的分布。 6、采用Lipofectamine2000试剂进行瞬时转染。 7、统计学处理：每次实验重复3次，数据以x±s表示，两组间差异采用Student's t test分析。P<0.05有统计学意义。 实验结果： 1、在MGC803，BGC823和SGC7901细胞中，100ng/mL的TRAIL导致轻度的增殖抑制，诱导不超过6％的细胞凋亡。奥沙利铂在MGC803，BGC823和SGC7901细胞中24h抑制细胞增殖50％的药物浓度(IC50)分别是22.56±6.55，37.47±7.67和33.92±8.01μg/mL。与单药奥沙利铂和TRAIL相比，奥沙利铂(各自的IC50剂量)联合TRAIL(100ng/mL)引起明显的细胞增殖抑制和细胞凋亡。当奥沙利铂和TRAIL联合作用MGC803细胞后，可以见到更明显的线粒体跨膜电位下降，caspase—3和caspase—8裂解，Bcl—2表达下调。5—FU和TRAIL协同诱导胃癌细胞凋亡已有报道，在本实验中作为阳性对照。5—FU作用MGC803细胞48h抑制细胞增殖50％的药物浓度(IC50)是2.07±1.14μg/mL。与单药5—FU和TRAIL相比，5—FU(48h的IC50剂量)联合TRAIL(100ng/mL)引起明显的细胞增殖抑制和细胞凋亡。当5—FU和TRAIL联合作用MGC803细胞后，可以见到更明显的线粒体跨膜电位下降，caspase—3和caspase—8裂解，Bcl—2表达下调。 2、与对照组相比，100 ng/mL TRAIL作用MGC803细胞没有引起明显的脂筏聚集和DR4，DR5聚集。但是22.56μg/mL奥沙利铂明显促进DR4和DR5在聚集脂筏内的定位。奥沙利铂和TRAIL联合作用与奥沙利铂单药相比，引起脂筏和死亡受体共聚集的程度相似。 3、制霉菌素是一种胆固醇分离剂能破坏脂筏。用50μg/mL制霉菌素预处理MGC803细胞1h，部分阻止了奥沙利铂引起的脂筏聚集和DR4，DR5聚集。制霉菌素处理MGC803细胞24h后引起了少量的细胞凋亡。加入奥沙利铂前用制霉菌素预处理1h，有减少奥沙利铂诱导细胞凋亡的趋势。此外，加入奥沙利铂和TRAIL前用制霉菌素预处理1h，凋亡细胞的比率由41.79±5.48％减少到29.52±3.99％。 4、22.56μg/mL奥沙利铂作用MGC803细胞8h后轻度抑制了c—Cbl和Cbl—b的表达，处理16h和24h后明显减少了c—Cbl和Cbl—b的表达。100ng/mL TRAIL作用MGC803细胞16h没有改变c—Cbl的表达，但轻度上调了Cbl—b的表达。奥沙利铂和TRAIL联合作用MGC803细胞16h后，下调c—Cbl和Cbl—b的程度与单药奥沙利铂下调的程度相似。 5、使用Lipo2000瞬时转染野生型c—Cbl和Cbl—b的表达载体进入MGC803细胞，转染48h后用Western blot的方法证实c—Cbl和Cbl—b的表达量提高。与阴性对照相比，在c—Cbl，Cbl—b，c—Cbl联合Cbl—b转染的细胞中，奥沙利铂，奥沙利铂+TRAIL诱导的MGC803细胞脂筏聚集被部分抑制。 结论： 1、奥沙利铂增强TRAIL诱导的MGC803，BGC823和SGC7901细胞凋亡。在协同作用中有更明显的线粒体跨膜电位下降，caspase—3和caspase—8裂解，Bcl—2表达下调。5—FU和TRAIL作用胃癌细胞后也有相似的结果。 2、奥沙利铂促进MGC803细胞的DR4和DR5募集在聚集的脂筏内。 3、制霉菌素部分阻止了奥沙利铂诱导的脂筏聚集和DR4，DR5聚集，并减少了奥沙利铂和TRAIL诱导的MGC803细胞凋亡。 4、在MGC803细胞内，奥沙利铂下调了c—Cbl和Cbl—b的表达。 5、在MGC803细胞内，c—Cbl和/或Cbl—b的过表达部分逆转了奥沙利铂诱导的脂筏聚集。

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声明

论文一u3000奥沙利铂增强TRAIL诱导胃癌MGC803，BGC823和SGC7901细胞凋亡

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 奥沙利铂通过促进死亡受体在脂筏内聚集增强TRAIL诱导胃癌MGC803细胞凋亡

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三u3000泛素连接酶c-Cb1和Cb1-b调控奥沙利铂诱导的胃癌MGC803细胞脂筏聚集

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展

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