酿酒酵母和解脂耶氏酵母异柠檬酸脱氢酶磷酸化调控机制研究

摘要

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是三羧酸循环中的关键酶之一，与NAD(P)+结合，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸、CO2和NAD(P)H。IDH在生物合成、能量代谢以及抗氧化等方面发挥重要作用。根据系统发生分析，可将IDH家族蛋白分为I型、II型和单体型三大IDH亚家族。
　　研究发现，来自大肠杆菌(Escherichia coli)的异柠檬酸脱氢酶(EcIDH)受磷酸化作用的调节，EcIDH的可逆磷酸化作用控制着细胞内的碳通量在TCA循环和乙醛酸旁路中的分配。当大肠杆菌处于乙酸等贫瘠碳源环境时，EcIDH中位于第113位的丝氨酸(Ser113)会被一个双功能酶，即异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(IDHkinase/phosphatase,IDHK/P)磷酸化，导致其丧失约75％的活性，迫使碳源流入乙醛酸旁路。EcIDH的磷酸化调控机制只在一些细菌中存在，而真核生物基因组中不存在IDHK/P同源序列，因此认为真核生物IDH不能受磷酸化的调控。
　　基于结构的真核生物和原核生物IDH序列比对显示，不同来源的IDH中都含有与EcIDH的Ser113相对应的保守Ser。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) IDH(ScIDH)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)IDH(YlIDH)的序列中，也有与之相应的关键Ser，分别是Ser95和Ser103。ScIDH和YlIDH是NADP+依赖型IDH，属于II型IDH亚家族成员。
　　IDH的磷酸化调控机制研究主要集中于I型IDH，为了研究保守的Ser在真核生物II型IDH中的作用，本研究通过定点突变，将Ser95和Ser103分别突变成Asp(D)和Glu(E)，以模拟IDH的持续磷酸化状态，得到了ScIDH突变体体酶S95D及S95E和YlIDH突变体体酶S103D及S103E。另外，为了研究该丝氨酸位点上不同侧链基团对IDH活性的影响，我们分别将ScIDH和YlIDH中丝氨酸突变为带有不同侧链基团的甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和酪氨酸。将2个野生型酶ScIDH和YlIDH，以及12个突变体酶进行原核表达、纯化、酶动力学参数的测定。SDS-PAGE结果显示，野生型酶和突变体酶的亚基分子量均为45 kDa左右。CD光谱分析的结果显示，野生型酶和突变体酶的二级结构十分相似，说明突变并没有引起ScIDH和YlIDH的二级结构的改变。酶动力学参数的测定结果显示，模拟磷酸化状态的4个突变体酶(S95D、S95E、S103D和S103E)的酶活大幅下降，几乎完全失活。另外8个突变体酶的活性也明显降低，说明Ser95或Ser103被含不同侧链基团的氨基酸取代，会严重影响IDH的活性。4个ScIDH突变体酶S95T、S95G、S95A和S95Y的活性分别只有野生型酶的38.07％、3.24％、2.65％和0.01％；4个YlIDH突变体酶S103T、S103G、S103A、S103Y的酶活分别只有野生型酶的44.26％、27.99％、16.29％和0.01％。实验结果表明Ser95和Ser103分别是ScIDH和YlIDH中潜在的磷酸化位点，对酶与底物的结合至关重要。
　　EcIDH的Ser113受磷酸化作用调控的结构基础，是Ser113及其相邻氨基酸残基形成的磷酸化环(phosphorylation Loop,P-loop)和IDH激酶/磷酸酶(IDHK/P或AceK)的识别片段(AceK recognition segment,ARS)。Ser113被磷酸化后，其空间结构发生变化，与底物异柠檬酸结合的部位变得较为狭窄，阻碍了EcIDH与异柠檬酸的结合。人细胞质IDH(HcIDH)也可以通过调节片段(regulatory segment)来调节自身的活性，由于构象的改变，导致HcIDH无法与底物异柠檬酸相结合，其调节方式在一定程度上类似于EcIDH的磷酸化作用机制。
　　基于结构的蛋白质序列比对分析显示，ScIDH、YlIDH及HcIDH中，与EcIDH的P-loop相对应的位置都插入了一段氨基酸序列，这些插入序列形成短的α-螺旋结构，可能影响IDHK/P对底物IDH的识别与结合。基因组序列分析显示，在人、酿酒酵母和解脂耶氏酵母的基因组中没有IDHK/P同源序列。但是HcIDH中的调节片段在真核生物和原核生物IDH中都很保守。因此，关于IDH磷酸化机制的进化起源，我们提出了可能的假设：一种是，古老的IDH包含磷酸化环、识别片段及调节片段，后来在环境的选择压力下，一些物种IDH中与磷酸化作用相关的磷酸化环及识别片段的功能被筛选出来，如EcIDH的磷酸化调控机制，而有些物种IDH中调节片段的潜在功能被筛选出来，如HcIDH的自我调控机制；另一种是，古老的IDH磷酸化机制与IDHK/P同时存在，但在进化过程中，一些生物体因长期不用而逐渐丢失了IDH磷酸化调控机制及IDHK/P，同时一些真核生物IDH演化出多种同工酶，以及更为经济有效的自我调节模式。由于磷酸化机制可能出现在辅酶特异性分化之前(数据未发表)，因此HcIDH的自我调控机制很可能是从磷酸化调控机制演化而来。
　　本研究已经证明了ScIDH和YlIDH中保守的Ser95及Ser103具有被磷酸化的潜能，为真核生物II型IDH中高度保守的磷酸化位点的功能和进化意义提供了一些实验依据，也为进一步探索IDH磷酸化调控机制的进化起源提供了科学参考。

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第一章 综 述

1 酿酒酵母和解脂耶氏酵母

1.1 酿酒酵母简介

1.2 解脂耶氏酵母简介

2 异柠檬酸脱氢酶

2.1 异柠檬酸脱氢酶简介

2.2 异柠檬酸脱氢酶的分类

2.3 异柠檬酸脱氢酶的空间结构

2.4 异柠檬酸脱氢酶的生理功能

2.5 异柠檬酸脱氢酶的调控机制

2.6 酿酒酵母中的异柠檬酸脱氢酶

2.7 解脂耶氏酵母中的异柠檬酸脱氢酶

3 研究目的与意义

参考文献

第二章 酿酒酵母和解脂耶氏酵母异柠檬酸脱氢酶磷酸化调控机制研究

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果与分析

2.1 突变方案的设计

2.2 突变体构建

2.3 ScIDH和YlIDH及其突变体酶的分子量检测

2.4 ScIDH和YlIDH及其突变体酶的圆二色谱分析

2.5 ScIDH和YlIDH及其突变体酶的酶学性质研究

3 讨论

3.1 异柠檬酸脱氢酶磷酸化调控机制的普遍性

3.2 异柠檬酸脱氢酶中保守的磷酸化位点——丝氨酸

参考文献

致谢

附：本人在读研期间发表和合作的科研论文获奖及参与课题情况