氧化葡聚糖包被的磁性纳米流体(Fe3O4@O-dextran)的定量检测及生物学效应研究

摘要

近年来，越来越多的研究者开始关注磁性纳米材料在生物医学领域的应用，如磁性分离和纯化、磁共振成像造影剂、靶向药物载体等。通常应用于生物医学上的材料，其准确的剂量对于优化材料的功效和降低副作用具有重要价值，所以，对有望用于生物医学上的磁性纳米材料进行定量检测和生物学评价显得十分重要。通过调研文献发现氧化葡聚糖包被的磁性纳米流体(Fe3O4@O-dextran)具有良好的水溶性、生物相容性、靶向性等优点，在生物医学领域具有巨大的应用潜力。本文通过建立酶联免疫分析方法对Fe3O4@O-dextran进行定量检测，通过应用免疫组织化学技术对Fe3O4@O-dextran进行生物学效应研究。
　　首先，我们将Fe3O4@O-dextran偶联上载体蛋白，制备成免疫原，然后将免疫原注射到新西兰大白兔体内，使其产生针对该物质的抗体。以抗原和抗体作为核心试剂，建立间接竞争酶联免疫分析方法和直接竞争酶联免疫方法定量检测Fe3O4@O-dextran。最后，利用常规染色法和免疫组化染色法研究该材料对新西兰大白兔肝脏的影响。具体内容如下：
　　1.Fe3O4@O-dextran免疫原和抗体的制备
　　根据文献报道的方法合成Fe3O4@O-dextran。Fe3O4@O-dextran没有免疫原性，需要将Fe3O4@O-dextran偶联上载体蛋白制备成免疫原。首先，通过形成酰胺键偶联，将Fe3O4@O-dextran用偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐偶联上牛血清白蛋白，得到免疫原。最后，将免疫原与佐剂混合经皮下注射到新西兰大白兔背部，首次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，待抗血清的效价达到1/64000，对新西兰大白兔进行采血。
　　2.间接竞争酶联免疫分析法定量检测Fe3O4@O-dextran
　　利用抗原抗体的特异性反应建立间接竞争酶联免疫分析法检测Fe3O4@O-dextran。优化了抗原抗体的浓度、封闭剂的浓度和抗原抗体的反应时间等条件，在最优条件下建立标准曲线，得到线性方程为A=1.17651-0.07137 lgC(A为吸光度值，C为Fe3O4@O-dextran的浓度)，相关系数R为-0.9991，线性范围为2.3×10-2~2.3×103 ng/mL，检出限为0.030 ng/mL，进行加标回收实验得到回收率为87.9%~117%。此外，考察了抗体特异性，发现其与尺寸相近纳米材料交叉反应率均小于0.01%。实验结果表明该方法检测Fe3O4@O-dextran具有灵敏度、安全性高、操作简单等优点。
　　3.直接竞争酶联免疫分析法定量检测Fe3O4@O-dextran
　　通过戊二醛法，将抗Fe3O4@O-dextran的抗体标记上辣根过氧化物酶(HRP)，制备了酶标抗体。利用抗原和酶标抗体特异性反应建立直接竞争酶联免疫分析法检测Fe3O4@O-dextran。优化了抗原和酶标抗体的浓度和反应时间、封闭剂的浓度等条件，在最佳条件下建立标准曲线，得到Fe3O4@O-dextran的浓度(C)与吸光度值(A)的线性关系为A=0.81668-0.08077 lgC，相关系数(R)为-0.9857，线性范围为1.0×10-3~1.0×102 ng/mL，检出限和加标回收率分别为0.047 ng/mL和81.0%~122%，其与尺寸相近的纳米材料的交叉反应率均小于0.01%。说明该方法检测Fe3O4@O-dextran准确性好、操作简单。
　　4.不同浓度的Fe3O4@O-dextran生物学效应研究
　　通过常规染色实验和免疫组化实验对含0.2 mg/mL和0.6 mg/mL Fe3O4@O-dextran的免疫原免疫后的结果进行生物学效应研究。利用苏木精-伊红染色法考察肝脏形态和结构的变化，利用免疫组化SABC染色法研究兔肝脏细胞上谷草转氨酶(GOT2)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，分别用image-Pro Plus和SPSS软件分析免疫组化图片和数据。结果表明，两实验组与空白对照组相比及两实验组之间没有明显的病理学变化且两个实验组中GOT2和α-SMA的表达量与空白对照组相比不存在统计学差异。

目录

声明

第一章 绪论

1.1纳米材料

1.2磁性纳米材料

1.3磁性纳米材料生物医学领域的应用

1.4磁性纳米材料的表征

1.5磁性纳米材料生物学效应研究

1.6课题设想

参考文献

第二章 氧化葡聚糖包被的磁性纳米流体抗原抗体的制备

2.1引言

2.2实验试剂与仪器

2.3实验方法

2.4结果与讨论

2.5结论

参考文献

第三章 间接竞争酶联免疫分析法定量检测Fe3O4@O-dextran

3.1引言

3.2实验试剂与仪器

3.3实验方法

3.4实验结果与讨论

3.5小结

参考文献

第四章 直接竞争酶联免疫分析法定量测定Fe3O4@O-dextran

4.1引言

4.2实验试剂与仪器

4.3实验方法

4.4实验结果与讨论

4.5小结

参考文献

第五章 氧化葡聚糖包被的磁性纳米流体生物学效应研究

5.1引言

5.2实验试剂与仪器

5.3实验方法

5.4结果与讨论

5.5小结

参考文献

工作总结与展望

硕士期间发表论文与申请专利及获奖情况

致谢