肺动脉平滑肌细胞内BRCC36在介导cGMP抑制TGF-β信号中的作用

摘要

目的:　　本研究旨在探讨BRCC36蛋白在介导cGMP抑制TGF-β信号中的作用，及其可能作用机制。　　方法:　　(1):采用组织块贴壁法，进行肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary arterysmooth muscle cells，PASMCs)原代培养，本实验采用第三代细胞作为实验对象，并采用大鼠平滑肌细胞特异性表达分子α-SMA，经免疫荧光染色技术，对所培养细胞进行纯度鉴定。　　(2):给予PASMCs cGMP(0.5mM)预处理1小时，而后再给予TGF-β1(2ng/ml)刺激12小时，提取细胞总RNA，以GAPDH为内参，采用RT-PCR的方法检测TGF-β1刺激标志物PAI-1的mRNA的表达情况。　　(3):给予PASMCs，TGF-β1(2ng/ml)刺激，选择12小时为时间点，提取细胞总蛋白，并采用Western blot的方法，以α-tubulin为内参，检测BRCC36蛋白的表达情况。　　(4):分别给予给予PASMCs转染空载体腺病毒(AD-NULL)和携带BRCC36过表达基因的腺病毒(AD-BRCC36)后，再给予cGMP(0.5mM)预处理1小时，接着给予TGF-β1(2ng/ml)处理12小时，提取总RNA，检测PAI-1的mRNA的表达情况。　　(5):给予PASMCs转染AD-BRCC36后，先后给予微管解聚剂诺考达唑(5 ug/ml)， cGMP(0.5mM)各处理1小时后，给予TGF-β1(2ng/ml)刺激12小时，提取总RNA，采用RT-PCR的方法，检测PAI-1的mRNA的表达情况。　　结果:　　(1)所培养肺动脉平滑肌细胞，形状为梭形，并成放射性生长，状态良好，纯度达到95％以上，基本符合后续实验要求。　　(2)采用cGMP预处理的方法激活ANP-cGMP-PKG信号通路，可以明显抑制TGF-β1诱导的PAI-1的表达，并且能够降低PAI-1的基础表达。　　(3)在给予TGF-β1刺激后，PASMCs内，较空白对照组，内源性BRCC36表达增加。　　(4)在转染AD-BRCC36的PASMCs，相较转染AD-NULL，cGMP对TGF-β1诱导的PAI-1表达的抑制作用增强，并且过表达BRCC36能够减少细胞内PAI-1的基础表达。　　(5)微管解聚剂诺考达唑处理后，能够去除，过表达BRCC36增强cGMP抑制TGF-β1信号通路的作用。　　结论:去泛素化酶BRCC36能够增强cGMP对TGF-β的抑制作用，并且依赖于β2-tubulin的结构完整性。其可能机制是BRCC36对Smad蛋白在泛素化水平进行了调控，并促进其与β2-tubulin结合增加，从而阻止其入核。

目录

摘要

论文说明

中英文缩写词表

第一章 前言

第二章：材料与方法

一：实验材料

二：实验方法

第三章：实验结果

一．大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)培养

二．观察在PASMCs内，cGMP对TGF-β诱导的PAI-1mRNA表达的抑制作用

三．观察TGF-β1刺激下，PASMCs细胞内BRCC36蛋白表达情况

四．观察在过表达BRCC36的情况下，对cGMP抑制TGF-β1诱导的PAI-1表达的影响

五．探讨微管解聚剂微管解聚剂诺考达唑，对过表达BRCC36促进cGMP抑制TGF-β1诱导的PAI-1表达的影响

第四章：讨论

第五章：结论

参考文献

综述 ANP的生物学功能及在肺动脉高压中的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

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