产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4菌毛特异性蛋白受体——猪源氨肽酶N的研究

摘要

新生和断奶仔猪腹泻是全球范围内影响养猪业发展的最为普遍的胃肠道疾病，主要与产肠毒素大肠杆菌(ETEC) F4（或K88）在仔猪肠道内的黏附、定植和感染有关，该病原不仅能够引发仔猪黄痢、白痢、水肿病和断奶仔猪腹泻等多种疾病，还易混合和继发多种疾病感染。ETEC F4病原菌有ab、ac、ad三种血清型变异株，其中以F4ac最为常见。这三种血清型F4大肠杆菌在肠道细胞黏附力、黏附素faeG基因和致病性上具有一定的差异。研究发现，ETEC F4能否特异性结合猪小肠黏膜上皮细胞，取决于猪小肠黏膜上有无相应的受体，无F4受体的猪表现为抗性，不会感染F4大肠杆菌发病；而有受体的猪则表现为敏感，在感染F4大肠杆菌后发病。也就是说，F4ab、F4ac、F4ad大肠杆菌在宿主肠道内的黏附、定植和感染取决于F4ab、F4ac、F4ad菌毛和小肠黏膜上特异性受体之间的互作。　　自1975年以来，有关F4菌毛受体的相关基因和蛋白陆续被报道，但遗憾的是，选择并鉴别真正的受体基因或候选蛋白仍然是研究的难点，而对于已经发现的受体基因和蛋白，也仍然缺乏直接有效的方法和证据来进行鉴别。近年来，猪源氨肽酶N (APN)被报道称是一种新型的F4菌毛黏附受体，并在F4 ETEC细菌的内化和机体免疫过程中发挥了重要的作用。因此，本研究选取APN蛋白作为研究对象，通过多种方法验证其作为ETEC F4的直接受体蛋白的可能性和可信度，并确定其功能结合域，从而获得抗病育种的目的基因或靶标蛋白，进而探讨F4+三种不同血清型变异株的感染致病机制和相关信号通路，为研发新型有效候选疫苗和培育抗病性优势猪种提供技术支撑，旨在从根本上减少或控制仔猪细菌性腹泻的发生。　　由于黏液素4（MUC4）基因内含子7的多态性变异位点与大多数ETEC F4的黏附表型相关，本研究通过检测MUC4基因内含子7的多态性来对不同猪种的不同个体进行初步分型，结合新鲜屠宰猪肠道的刷状缘细胞的细菌黏附实验结果，确定实验样本猪。提取猪空肠RNA后PCR获得APN的全长基因，体外表达、纯化APN蛋白，免疫小鼠并制备相应的多克隆抗体。利用Red同源重组的方法构建F4+ ETEC菌毛缺失株，同时构建携带fae全操纵子表达的SE5000重组菌，并进行了上述缺失株、重组菌及野生菌的体外黏附实验、黏附抑制实验。同时，构建能够稳定表达的APN过表达细胞系pEC129-APN IPEC-J2和APN沉默细胞系pcDNA TM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2，将表达出的蛋白与活体分离的APN蛋白进行功能性对比，通过酶活性实验、细胞免疫组化等确定原核表达、真核表达蛋白以及生物体内APN蛋白的酶活性及其对于宿主细胞识别病原菌能力的影响。利用酵母双杂交、Pull-down和Western blot等方法验证蛋白-蛋白之间的相互作用，为APN蛋白与菌毛蛋白的直接互作提供证据。同时，探讨APN蛋白对F4大肠杆菌体外黏附的影响，APN蛋白与F4菌毛蛋白互作的功能性结合域，比较APN蛋白与F4三种血清型互作的差异，并初步探究锌离子依赖型蛋白APN在锌离子作用条件下的作用机理和相关信号通路，主要研究内容分为以下6个部分：　　1．猪产肠毒素大肠杆菌F4受体的初步分型　　有研究表明，ETEC F4的受体基因可被精细定位于猪染色体SSC13q41区域，并与MUC4基因密切相关。根据MUC4基因内含子7在限制性内切酶XbaⅠ作用下所表现出的多态性，可以在基因水平上将所检测的猪分为易感型纯合子SS，易感型杂合子SR和抵抗型RR。本实验利用MUC4基因多态性的这一特性，对送检猪的样品进行初步的分型检测，并结合新鲜屠宰猪肠道刷状缘细胞的黏附表型结果筛选目的样本，选取基因分型结果和细菌黏附实验结果相一致的对应样本，即代号长白202和梅山2877对应猪的样品进行后续实验，两者分别为易感型纯合子和易感型杂合子，且小肠刷状缘细胞的细菌黏附实验结果均为强黏附型。　　2．猪源氨肽酶N基因的克隆和表达系统的构建　　为探讨APN作为产肠毒素大肠杆菌F4受体蛋白的可能性，根据GenBank上猪APN mRNA序列设计合成特异性引物，从新鲜屠宰的梅山仔猪易感个体小肠组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链，RT-PCR扩增猪APN全长基因，并分别构建真核表达和原核表达系统。重组质粒测序和酶切结果显示：APN基因己正确插入pcDNA3.1真核表达载体和pET-28a(+)原核表达载体，SDS-PAGE结果证明重组蛋白为包涵体，且纯化产物在110 KDa处有单一明显条带。pcDNA3.1-APN和pET28a-APN双系统的成功构建以及APN蛋白的成功表达，为进一步研究和验证该蛋白作为猪F4菌毛受体候选蛋白的可能性奠定了基础和平台。　　3．FaeG介导猪源氨肽酶N与产肠毒素大肠杆菌ETEC F4+的黏附　　FaeG亚单位是菌毛主要的功能性亚基，该亚单位与糖蛋白或糖脂受体识别相关，有助于病原菌附着到宿主细胞。本研究利用构建所得的大肠杆菌F4+ fae全操纵子基因表达的重组菌和ΔfaeG缺失株探讨APN与大肠杆菌F4+FaeG亚基之间的相互作用。结果显示，纯化后的APN蛋白能够和F4+ETEC之间发生肉眼可见的凝集反应，证明该蛋白能够识别并结合三种血清型的F4+菌毛，而ΔfaeG缺失株与APN蛋白之间的凝集反应明显减弱。酵母双杂交、pull-down等实验的阳性结果也证明，FaeG亚单位蛋白与APN蛋白之间也能够直接发生相互作用，这些结果证明FaeG是菌毛有效的直接黏附功能亚基，也是APN蛋白作用的靶点部位。　　4.猪氨肽酶N对产肠毒素大肠杆菌(ETEC) F4黏附力的影响　　有研究表明，APN能够促进小肠上皮细胞内吞F4ac菌毛，诱导黏膜免疫的发生。前期研究中，我们发现APN蛋白与F4菌毛的主要亚单位FaeG蛋白间存在直接的相互作用。本研究中，利用筛选获得的APN静默稳定表达细胞系pcDNA TM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2/Caco-2和APN过表达稳定细胞系pEC129-APN IPEC-J2/Caco-2进行一系列的功能验证试验，以未处理的IPEC-J2/Caco-2细胞作为对照，探讨APN对大肠杆菌F4黏附力的影响。结果表明，与对照组细胞相比，RNAi干扰细胞系的APN表达量明显降低，pEC129-APN细胞系的APN表达量则显著高于上述两个细胞系；而细胞对细菌的黏附能力则与细胞中APN的表达量变化呈正相关。　　5．猪源氨肽酶N功能结合域的研究　　在前期研究中，我们发现，APN与F4菌毛的主要亚单位FaeG之间存在直接的蛋白互作，而APN表达量的高低能够直接影响细胞对细菌的黏附。为了进一步验证APN在F4菌毛与宿主细胞相互作用中发挥的功能，探究其作用机理，本实验利用重叠多肽阵列技术高通量筛查APN与F4ab、F4ac、F4ad菌毛FaeG亚单位的互作位点，并结合Pull-down、Western blot等试验进行验证，最终确定APN的功能结合域。比较APN蛋白与F4三种血清型FaeG蛋白的结合位点，可知APN-FaeG的结合位点主要集中于F4ab FaeG蛋白的148-160、199-217位氨基酸(aa)残基；F4ac FaeG蛋白的149-161、176-188、200-218位氨基酸( aa)残基；F4ad FaeG蛋白的149-161、200-218位氨基酸(aa)残基。　　6．猪源氨肽酶N作用机理的探究　　锌离子( Zn2+)是猪生长发育过程中重要的微量金属离子，Zn2+的缺乏常常会导致仔猪生长发育不良，而适量的高锌饲料不仅有利于仔猪的健康生长，还能明显减少仔猪下痢。APN是一种锌离子依赖型的膜结合外肽酶，具有锌离子结合激活位点。前期研究表明，高浓度的Zn2+溶液能够降低APN蛋白的生物学活性。为了探讨APN蛋白与Zn2+之间的相关性，以及它们在F4大肠杆菌黏附、定植、诱发疾病过程中的作用机理，本实验针对与APN基因转录和体内Zn2+浓度变化都密切相关的蛋白激酶MAPK信号通路，以及相关的细胞因子展开了探索研究。研究发现，在一定的浓度范围内，Zn2+能够减少F4大肠杆菌对细胞的黏附，还能够对细胞内ERK、p38、JNK蛋白的磷酸化以及相关细胞因子的表达产生影响。

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