CD4+IL-17+细胞在胰腺癌肿瘤微环境中的分布、表型特征、分化募集机制及临床意义的实验研究

摘要

第一部分,CD4+IL-17+细胞在胰腺癌肿瘤微环境及患者外周血的分布　　 目的:研究胰腺癌肿瘤组织及患者外周血中CD4+IL-17+细胞的比例，分析其在胰腺癌肿瘤微环境及患者外周血中的分布。　　 方法:应用流式细胞分析技术(FACS)检测26例胰腺癌组织和20例胰腺癌患者外周血中CD4+IL-17+细胞的比例，26例相对应的癌旁正常胰腺组织和20例健康志愿者作为对照组。应用FACS检测26例胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织中CD8+IL-17+细胞的比例。根据胰腺癌不同临床分期及有否淋巴转移分组，比较CD4+IL-17+细胞比例的差异。分析比较同一例胰腺癌患者的肿瘤组织、癌旁正常胰腺组织和外周血中CD4+IL-17+细胞的差异。　　 结果:胰腺癌组织肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中CD4+IL-17+细胞的比例明显高于癌旁正常胰腺组织癌旁浸润淋巴细胞(NIL）中CD4+IL-17+细胞的比例(5.28±1.65％VS3.37±0.93%，P＜0.05)，并且CD4+IL-17+细胞在Ⅲ～Ⅳ期肿瘤组织中的比例明显高于Ⅰ～Ⅱ期肿瘤(6.98±2.78%VS4.41±1.09%，P＜0.05)。CD8+IL-17+细胞在TIL中的比例略高于在NIL中的比例(0.98%，0.41～1.52%VS0.72%，0.22～1.28%，P＞0.05)。胰腺癌患者外周血中CD4+IL-17+细胞的比例高于对照组健康志愿者(2.58±1.05%VS1.18+0.32%，P＜0.05)。Ⅲ～Ⅳ期胰腺癌患者外周血中CD4+IL-17+细胞比例明显高于Ⅰ～Ⅱ期肿瘤(3.55±1.49%VS2.08±0.78%，P＜0.05)。有淋巴转移的胰腺癌患者外周血中CD4+IL-17+细胞比例明显高于无淋巴转移的胰腺癌患者(4.01±1.66%VS2.39±1.13%，P＜0.05)。对于同一例胰腺癌患者的肿瘤组织、癌旁正常胰腺组织和外周血，CD4+IL-17+细胞比例在肿瘤组织中最高(5.05-1.71%)，在外周血中最低（2.19±0.68%）。　　 结论:CD4+IL-17+细胞在胰腺癌肿瘤组织中的分布明显高于癌旁正常胰腺组织，在患者外周血中的分布明显高于健康志愿者。在同一例胰腺癌患者中，CD4+IL-17+细胞在肿瘤组织中的分布最高，在外周血中的分布最低。CD4+IL-17+细胞的分布呈现在胰腺癌肿瘤微环境中的聚集现象。　　 第二部分,胰腺癌肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞的表型特征及功能研究　　 目的:研究胰腺癌肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞的表型特征及其相关细胞因子、特异性转录因子的表达。　　 方法:应用FACS检测20例胰腺癌肿瘤组织中IL-17+细胞的T细胞表达、CD4+IL-17+细胞的T细胞功能标记(HLA-DR、CD25、PD-1、Foxp3、CD45RO、CD45RA)表达、趋化因子受体(CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CXCR4)表达及其与不同免疫细胞亚群(Th1、Th2、Treg、肿瘤相关巨噬细胞)的相关性。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Realtime-PCR)技术检测20例胰腺癌肿瘤组织中CD4+IL-17+细胞相关细胞因子(IL-17A、IL-23、IL-6、TGF-β、IL-1β)和特异性转录因子RORγt的表达水平。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测20例胰腺癌患者外周血中CD4+IL-17+细胞相关细胞因子(IL-17、IL-23)的浓度。　　 结果:FACS检测胰腺癌TIL和NIL均可表达IL-17，但在淋巴细胞中，绝大多数IL-17由CD4+细胞表达，极少数由CD8+细胞表达。胰腺癌肿瘤组织中CD4+IL-17+细胞表面低表达传统T细胞活化标记HLA-DR和CD25分子，也低表达抑制性功能T细胞标记PD-1和Foxp3分子，并呈现CD45RO+CD45RA-的记忆性T细胞的表型。肿瘤组织中CD41L-17+细胞表面低表达趋化因子受体CCR1、CCR5和CCR7，而高表达趋化因子受体CCR2、CCR4、CCR6和CXCR4。肿瘤组织中的CD4+IL-17+细胞数量与Th1成负相关，与Treg细胞成正相关，而与Th2细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)无明显相关性。Realtime-PCR检测显示肿瘤组织中CD4+IL-17+细胞相关细胞因子IL-17A、IL-23、IL-6、TGF-β和IL-1β以及特异性转录因子RORyt的表达水平均高于癌旁正常胰腺组织(P＜0.05)。ELISA检测显示胰腺癌患者血浆中IL-17(69.2±28.5pg/ml)和IL-23(266.5±98.1pg/ml)的浓度均高于对照组健康志愿者(P＜0.05)，并且Ⅲ～Ⅳ期胰腺癌患者的IL-17(75.8±29.0pg/ml)和IL-23(279.9±102.1pg/ml)的浓度明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＜0.05)。　　 结论:胰腺癌肿瘤组织中的CD4+IL-17+细胞有其自身的T细胞功能标记及趋化因子受体表达谱等表型特征。胰腺癌肿瘤组织中高表达CD4+IL-17+细胞相关的细胞因子和特异性转录因子。胰腺癌患者外周血中分泌高水平的CD4+IL-17+细胞相关的细胞因子。　　 第三部分,胰腺癌肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞的分化及募集的机制探讨　　 目的:探讨胰腺癌肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞产生分化及CD4+IL-17+细胞迁徙募集至肿瘤微环境的可能机制。　　 方法:应用FACS从胰腺癌肿瘤组织中分离出TAM，患者外周血FACS分离出的正常巨噬细胞（Mφ）作为对照组。应用免疫磁珠(MACS)从患者外周血中分选出CD4+初始T细胞。将TAM和Mφ分别与初始T细胞及肿瘤细胞按比例共培养48h后，FACS检测CD4+IL-17+细胞的比例，Realtime-PCR和ELISA检测CD4+IL-17+细胞相关细胞因子的水平。Realtime-PCR检测TAM分泌的细胞因子，分组单独或联合加入细胞因子抗体，采用细胞因子阻断实验后FACS检测CD4+IL-17+细胞的比例变化。FACS分离出肿瘤组织中的Treg细胞，按不同比例加入上述共培养体系中，FACS检测CD4+IL-17+细胞的比例变化。应用FACS检测肿瘤组织和患者外周血中CD4+IL-17+细胞表面的趋化因子受体(CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7)的表达。趋化实验检测趋化因子(RANTES、MCP-1、CCL22、CCL20)对CD4+IL-17+细胞的趋化作用。Realtime-PCR检测胰腺癌肿瘤微环境中上述趋化因子的表达水平。　　 结果:TAM和Mφ分别与初始T细胞及肿瘤细胞共培养后，FACS检测显示TAM诱导分化CD4+IL-17+细胞的比例明显高于Mφ(2.57±0.83%VS5.28±1.65%，P＜0.05)。Realtime-PCR和ELISA检测显示TAM诱导分化CD4+IL-17+细胞相关细胞因子的水平明显高于Mφ(P＜0.05），并呈剂量依赖性。TAM比Mφ分泌高水平的细胞因子IL-23、IL-6和IL-1β(P＜0.05)。细胞因子阻断实验结果显示单独阻断IL-23或IL-6后CD4+IL-17+细胞的比例明显低于单独阻断IL-1β或TGF-β后CD4+IL-17+细胞的比例(P＜0.05）。联合阻断IL-23和IL-6后CD4+IL-17+细胞比例的减少更为明显(P＜0.05)，肿瘤组织中的Treg细胞可以抑制CD4+IL-17+细胞的分化，并呈剂量依赖性。FACS检测肿瘤组织中CD4+IL-17+细胞表面高表达趋化因子受体CCR2、CCR4和CCR6，低表达CCR1；而胰腺癌患者外周血中CD4+IL-17+细胞表面高表达趋化因子受体CCR2和CCR6，中等表达CCR4，低表达CCR1。趋化实验显示趋化因子MCP-1和CCL20对外周血CD4+IL-17+细胞的迁移能力明显高于CCL22和RANTES(P＜0.05)。Realtime-PCR检测胰腺癌肿瘤组织中MCP-1和CCL20的表达量较高，并且明显高于癌旁正常胰腺组织(P＜0.05)，而CCL22和RANTES在肿瘤组织中的表达量较低，并且与癌旁正常胰腺组织中的表达无明显差异。　　 结论:胰腺癌肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞的诱导分化与TAM密切相关。在TAM分泌的一系列细胞因子中，IL-23和IL-6起主要作用。TAM通过分泌系列细胞因子，可能是CD4+IL-17+细胞在肿瘤微环境中产生分化的主要机制。肿瘤组织中表达的趋化因子MCP-1和CCL20能特异性与外周血中CD4+IL-17+细胞高表达的趋化因子受体CCR2和CCR6相互作用迁徙募集CD4+IL-17+细胞，可能是CD4+IL-17+细胞在肿瘤微环境中聚集的主要机制。　　 第四部分,胰腺癌肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞的临床意义　　 目的:研究胰腺癌肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞的表达与肿瘤血管生成、临床病理特征、预后生存的相关性，探讨胰腺癌肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞的临床意义。　　 方法:应用免疫组织化学方法(IHC)检测20例临床切除的胰腺癌标本中CD34、VEGF的蛋白表达。计算微血管密度值(MVD)作为判断血管生成的指标，分析肿瘤微环境中CD4+IL-17+细胞的比例与肿瘤血管生成的相关性。应用IHC检测51例临床切除的胰腺癌标本中IL-17的蛋白表达和分布，分析肿瘤组织中IL-17+细胞的表达水平与肿瘤临床病理特征、预后生存的相关性。　　 结果:胰腺癌组织中MVD及VEGF的表达与相应CD4+IL-17+细胞的比例呈正相关。IHC结果显示IL-17+细胞在肿瘤组织中主要表现为分布在胞浆中的棕色颗粒。IL-17+细胞在肿瘤组织中的阳性表达率高于癌旁正常胰腺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。IL-17+细胞在肿瘤组织中的表达水平与胰腺癌患者的TNM分期和淋巴转移相关(P＜0.05)，而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、组织学分级和局部浸润无明显相关性(P＞0.05)。51例胰腺癌患者中有50例获得随访资料，随访成功率为98.0%，随访时间为2～67个月，患者中位生存时间为（16.6±4.8）个月。IL-17+细胞在肿瘤组织中的高低表达与患者术后总体生存时间有关(P＜0.05)。Cox模型单因素分析显示与胰腺癌患者总体生存时间相关的指标有肿瘤大小、TNM分期、淋巴转移和肿瘤组织中IL-17+细胞的表达水平，而Cox模型多因素分析显示仅有TNM分期可以作为判断胰腺癌患者预后的独立因素。　　 结论:腺癌肿瘤组织中CD4+IL-17+细胞的比例与肿瘤微血管密度呈正相关，提示CD4+IL-17+细胞的表达与肿瘤血管生成具有相关性。IL-17+细胞在胰腺癌肿瘤组织中有原位表达，其表达水平与临床病理特征(TNM分期和淋巴转移)及患者总体生存时间有关。肿瘤组织中IL-17+细胞的表达水平与胰腺癌患者的预后密切相关，可作为判断患者预后的指标之一。