水产养殖环境中磺胺类抗生素抗性基因污染的研究

摘要

抗生素不仅可以防治水产生物的细菌性疾病，同时还可以促进养殖动物的生长，因此在水产养殖业中的使用极为广泛。近年来，随着抗生素使用的加剧，养殖生态环境所遭受的抗生素污染日益严重，并由此诱导产生了一种新型的环境污染物——抗生素抗性基因(ARGs)。抗性基因可以通过基因的水平转移进入人体，影响人类的健康，已经引起了国内外的广泛关注。　　本文试图以磺胺类抗生素为目标化学物，通过研究太湖周边养殖区域（无锡、湖州、常州、苏州、宜兴）不同养殖品种（河蟹、青虾、鲈鱼、青鱼、鲫鱼、鳊鱼、南美白对虾）养殖池塘的水体和底泥沉积物中抗生素的残留、抗性菌株的情况以及抗生素抗性基因的污染现状和变化规律，并与相近的自然水域相比较，了解养殖水环境中抗生素抗性基因的污染残留状况。研究结果如下:　　1、分析了2015年不同地区不同品种的养殖池塘在整个养殖周期中水样和沉积物中磺胺类药物的分布情况，发现在整个养殖季节中，池塘水体和沉积物中磺胺类的含量变化均呈现低-高-低的变化趋势;　　2、整个养殖过程中，不同养殖池塘的水样、沉积物中均可检出磺胺类的耐药微生物。随着磺胺二甲基嘧啶浓度的升高，养殖池塘的水样、沉积物中微生物的耐药率均呈现下降趋势，且浓度越高，耐药菌的耐药率越低。同时，相同药物浓度下，沉积物中细菌的耐药率要高于水中。　　3、通过抗性平板分离筛选出具有耐药性的抗性菌株4株，结合菌体生理生化特性分析和16S rDNA序列分析，初步确定NHA1401、NHA1402菌株为奇异变形杆菌（Proteus mirabilis），SHA1501、CBA1506菌株为葡萄球菌属(Chryseobacteriumsp.)和金黄杆菌属(Staphylococcus sp.)的细菌。　　4、采用PCR方法对环太湖不同养殖区域不同养殖品种的养殖池塘，在同一养殖周期的不同时段（2015年的5-6月、7-8月、9-10月）的水样和沉积物进行磺胺类抗性基因sulⅠ和sulⅡ的定性分析，结果显示，在3个不同的养殖时段中，均可检出磺胺类抗性基因sulⅠ和sulⅡ。养殖前期（5-6月）2种磺胺类抗性基因的检出率最低，分别为80％和65％。随着养殖进程的推进，sulⅠ基因呈现出先升高后下降的趋势，sulⅡ抗性基因检出率则在不断升高。与此同时，磺胺类抗性基因sulⅠ、sulⅡ在太湖自然水体和沉积物中也有检出。　　5、通过荧光定量PCR方法分析了环太湖不同养殖区域不同养殖品种的养殖池塘中的水样和沉积物，在同一养殖周期的不同时段的磺胺类抗性基因sulⅠ和sulⅡ的相对丰度，结果显示，(1)环太湖水产养殖区不同地区相同品种的养殖池塘环境中磺胺类抗性基因的相对丰度差异不大，最大不超过一个数量级;(2)在相同地区不同品种的水产养殖池塘中，南美白对虾、青鱼、鲈鱼养殖池塘中的污染较青虾、鳊鱼为重。除河蟹外，青虾、南美白对虾、鲈鱼、鲫鱼、鳊鱼和青鱼6个品种养殖池塘的水体遭受到的污染程度比沉积物要重，而河蟹养殖池塘则沉积物的污染较重。在水产养殖环境中，无论是水中还是沉积物中，抗性基因都是存在的，且差异性最大在1～2个数量级之间;(3)在相同地区、相同养殖品种的同一个养殖周期中，几乎有90％的养殖池塘，其磺胺类抗性基因相对丰度的最高值出现在养殖中期的7-8月，只有极少数的例外。　　6、在太湖自然水体中，不同地理位置水域的水样和沉积物中磺胺类抗性基因的相对丰度存在一定的差异，沉积物中磺胺类抗性基因的污染较水体为重。与同期附近的养殖区域相比，天然水体水样中的污染程度轻于养殖区，而沉积物中的污染程度与养殖区相当。　　研究表明，水产养殖环境中的抗生素抗性基因并非长期固定累积存在于池塘中，磺胺类抗性基因的产生与养殖周期、养殖中抗生素的投放和使用量存在一定的联系。因此，严格规范和控制养殖过程中抗生素的使用，对抗性基因的产生和传播可起到一定的防范作用，从而使抗性基因的转移得到有效遏制，为人类健康提供保障。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1 水产养殖业中抗生素的使用情况

2 水产养殖环境中的抗生素抗性基因来源与扩散

2．1 抗生素抗性基因的来源

2．2 抗生素抗性基因在水产养殖环境中的传播扩散方式

3 抗生素抗性基因转移方式

3．1 抗性基因水平转移的分子传播元件

3．2 抗性基因水平转移的分子机制

4 抗生素抗性基因的研究现状

4．1 水域中ARGs的分布

4．2 水体环境不同介质中ARGs的分布

4．3 水产养殖水体环境中的ARGs

5 抗生素抗性基因的检测方法

5．1 传统微生物抑制试验法

5．2 分子生物学技术

6 水产养殖环境中抗生素抗性基因研究存在的问题

7 展望

8 本课题的研究意义与研究内容

8．1 本课题的研究目的和意义

8．2 本课题的研究内容

第二章 水产养殖环境中磺胺类耐药菌株的筛选鉴定

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 水产养殖池塘中磺胺类药物的分布和变化

2．2 水产养殖环境中磺胺类耐药菌的耐药率

2．3 水产养殖池塘中磺胺类耐药菌株的分离与鉴定

3 小结

3．1 水产养殖池塘中磺胺类药物的分布和变化

3．2 水产养殖池塘中磺胺类耐药菌及其分离鉴定

第三章 太湖流域主要水产养殖区磺胺类抗性基因污染特征的定性分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 样品DNA提取结果

2．2 磺胺类抗性基因的PCR定性结果

3 小结

第四章 太湖流域主要水产养殖区磺胺类抗性基因污染特征的定量分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 磺胺类抗性基因在不同养殖区域相同养殖品种池塘中的丰度特征

2．2 磺胺类抗性基因在相同养殖区域不同养殖品种池塘中的丰度特征

2．3 磺胺类抗性基因在相同养殖周期中不同养殖时段的丰度特征

2．4 磺胺类抗性基因在太湖水体中的相对丰度特征

3 小结

全文总结

参考文献

致谢

科研情况