利用16S rDNA测序技术分析腹泻仔猪肠道菌群结构特征及灌服粪肠球菌对其调节作用

摘要

肠道微生物与机体的健康息息相关。仔猪在哺乳期因生理缺陷、外界环境压力、食物变化等原因常导致肠道菌群紊乱，发生腹泻。腹泻同样会加剧肠道微生物的紊乱，生产性能下降，并造成巨大经济损失。有研究表明宿主的肠道微生物与性别相关，但也一些截然相反的结果。微生态制剂作为一种理想的抗生素替代品常用来调节猪肠道微生物平衡，预防和治疗仔猪腹泻。本文利用16S rDNA技术分析腹泻仔猪肠道菌群结构特征及灌服微生态制剂对仔猪肠道微生物的内在影响及其性别差异。　　本实验选择胎次、产期、产仔数相近的新生仔猪48窝，观察仔猪群健康状况，一旦发现某窝仔猪发生腹泻，立即选择该窝腹泻仔猪1头及同窝同性别未腹泻的仔猪1头采集血样、粪样，直至采集20窝仔猪样，并将这20窝仔猪随机分对照组(C)、试验组1(T1)、试验组2(T2)、试验组3(T3)、试验组4(T4)、每组4窝。五个组于腹泻当日(0d)、第3日(3d)、第6日(6d)全窝分别灌服双蒸水1mL(C)、粪肠球菌2.5×108 CFU/mL(T1)、5×108 CFU/mL(T2)、1×109 CFU/mL(T3)、2×109 CFU/mL(T4)的微生态制剂1mL。到20日龄时，每窝选择试验期间发生过腹泻与同性别从未腹泻的仔猪各一头采集血液样品和粪样。试验分为两个部分:　　1腹泻仔猪肠道微生物、免疫指标的情况　　本实验利用16S rDNA技术分析腹泻仔猪肠道微生物特征及其性别差异。结果表明:腹泻仔猪与未腹泻仔猪肠道微生物多样性没有差异，但在门水平上，腹泻组疣微菌门Verrucomicrobia(P=0.0419)的丰度显著高于未腹泻组;在属水平上，腹泻组消化链球菌属Peptostreptococcus（P=0.0195）的丰度显著高于未腹泻组，而丛毛单胞菌属Comamonas(P=0.0308)和Peptoniphilus(P=0.0243)的丰度显著低于未腹泻组;公仔猪组中Butyricimonas(P=0.0019)、Sharpea(P=0.0049)和Akkermansia（P=0.0168）的丰度显著显著高于母仔猪组。腹泻仔猪血液中免疫球蛋白M(IgM)浓度显著低于未腹泻仔猪组(P=0.049)。　　2灌服粪肠球菌微生态制剂对仔猪肠道微生物、免疫指标的影响　　参考本实验室前期关于粪肠球菌微生态制剂对仔猪腹泻、血液指标及生长性能影响的研究结果，挑选对照组(C)、试验组2(T2)、试验组4(T4)中同单元、同性别仔猪各6头，用以研究灌服粪肠球菌微生态制剂对仔猪肠道微生物的影响。结果表明，灌服粪肠球菌微生态制剂有治疗腹泻的功效，但没有改变仔猪肠道微生物的多样性和丰度。与对照组相比，灌服微生态制剂显著提高血液中IgA(P=0.0250)、IgM(P=0.0402)的浓度。此外，通过两个时间段对照组肠遭微生物的比较，我们发现仔猪肠道微生物的多样性和丰度随日龄改变;在门水平，3-7日龄组梭杆菌门Fusobacteria(P=0.015)的丰度显著低于20日龄组，但螺旋体门Spirochaetes(P=0.045)和纤维杆菌门Fibrobacteres(P=0.043)的丰度显著高于20日龄组。

目录

声明

摘要

中英文对照

引言

文献综述

1 肠道微生物

1．1 肠道微生物简介

1．2 肠道微生物的种类和分布

1．3 肠道微生物与宿主性别的关系

1．4 肠道微生物与宿主年龄的关系

1．5 肠道微生物与机体健康的关系

2 仔猪腹泻概况

2．1 仔猪腹泻的现状

2．2 仔猪腹泻的机制

2．3 腹泻的分类

2．4 仔猪的主要腹泻病

3 益生菌

3．1 益生菌的概念

3．2 益生菌的种类

3．3 益生菌的作用机制

3．4 益生菌对胃肠道健康的影响

3．5 益生菌对肠道疾病的治疗

4 益生菌在猪生产中的使用

4．1 液体发酵饲料

4．2 直接饲喂

5 分子生物检测肠胃道内微生物的方法

5．1 16S rRNA测序

5．2 16S rDNA测序

6 本实验的研究目的意义

第一章 腹泻仔猪肠道微生物、免疫指标的情况

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 饲养管理

1．3 样品采集

1．4 血液免疫指标的测定

1．5 粪样中常见引起腹泻的病毒检测

1．6 粪样中微生物的分析

1．7 MiSeq宏基因组测序实验流程

1．8 生物多样性分析

1．9 统计分析

2 结果与分析

2．1 腹泻对仔猪血液免疫球蛋白的影响

2．2 对仔猪粪样中病毒检测结果

2．3 腹泻与未腹泻仔猪粪便中微生物的差异分析

3 讨论

3．1 腹泻仔猪与未腹泻仔猪血液免疫求蛋白分析

3．2 腹泻仔猪与未腹泻仔猪肠道微生物分析

3．3 不同性别仔猪肠道微生物分析

第二章 灌服粪肠球菌微生态制剂对仔猪肠道微生物、免疫指标的影响

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 实验设计与饲养管理

1．3 样品采集

1．4 粪样中病毒的检测

1．5 血液免疫指标的测定

1．6 粪样中微生物的分析

1．7 统计分析

2 实验结果

2．1 病毒检测结果

2．2 血液指标检测结果

2．3 仔猪粪便中的微生物

2．4 不同日龄仔猪肠道微生物的变化

3 讨论

3．1 粪肠球菌微生态制剂在猪生产中的应用

3．2 灌服粪肠球菌微生态制剂对仔猪免疫影响

3．3 灌服粪肠球菌微生态制剂对仔猪肠道微生物的影响

3．4 不同日龄仔猪肠道微生物的变化

参考文献

全文结论

本研究的创新之处

致谢

攻读硕士期间研究成果