鲁西牛消化道各段T1R1、T1R3及pepT1基因的表达差异性研究

摘要

反刍动物氨基酸营养需要一直是研究的热点和难点。由于反刍动物采食的氨基酸有一部分会被瘤胃微生物降解,并且其代谢和生产的氨基酸需要量受生理状态和生产水平的影响,因此研究人员很难准确测定氨基酸的需要量。而氨基酸在反刍动物生产性能发挥中所起的重要作用又使得搞清氨基酸需要是一个迫切的问题。氨基酸营养需要测定的困难表现在理论和技术两个方面。其中理论上最重要的问题是关于氨基酸的吸收调控机制还没有完全搞清楚。　　T1R基因家族的T1R1基因和T1R3基因对氨基酸的识别发挥着重要的作用,其配体是氨基酸。越来越多的实验表明了T1R1基因和T1R3基因除了在味蕾中表达外,还在胃肠道中表达,并且是以异源二聚体的形式发挥作用的,参与氨基酸的吸收调控。为此,本文以实时荧光定量PCR的方法检测了在鲁西牛消化道各段中T1R1基因和T1R3基因的表达情况及其规律。　　动物体内对氨基酸的吸收主要是以小肽的形式进行吸收的,而小肽的吸收则需要依靠小肽转运蛋白载体,即pepT1,所以本研究同时还检测了pepT1基因在鲁西牛消化道各段中的表达情况,以揭示这3个基因的表达是否有相关的联系。通过实验我们得到了以下结果:　　1、鲁西牛消化道各段中T1R1基因的表达差异性　　消化道各段组织中T1R1基因的mRNA的表达表现了明显的差异性。其相对表达量(2-△△CT值)由高到低依次为空肠(29.34)、回肠(23.25)、瘤胃(21.50)、网胃(15.95)、十二指肠(11.01)、瓣胃(4.53)、皱胃(3.00)、盲肠(1.20)、胰腺(1.00)、结肠(0.98)和直肠(0.96),消化道各段表达差异显著(P<0.05)。其中空肠相对表达量与回肠和瘤胃差异不显著(P>0.05),与网胃、十二指肠、瓣胃、皱胃、盲肠、结肠、直肠和胰腺差异显著(P<0.05);回肠相对表达量与瘤胃和网胃差异不显著(P>0.05),与十二指肠、瓣胃、皱胃、盲肠、结肠、直肠和胰腺差异显著(P<0.05);十二指肠、瓣胃、皱胃、盲肠、结肠、直肠和胰腺差异不显著(P>0.05)。　　2、鲁西牛消化道各段中T1R3基因的表达差异性　　消化道各段组织中T1R3基因的mRNA的表达也表现了明显的差异性。其相对表达量(2-△△CT值)由高到低依次为空肠(29.34)、回肠(23.25)、瘤胃(21.50)、网胃(16.50)、十二指肠(10.98)、瓣胃(4.51)、皱胃(3.03)、盲肠(1.20)、胰腺(1.00)、结肠(1.00)和直肠(0.96),消化道各段表达差异显著(P<0.05),其中空肠相对表达量与回肠和瘤胃差异不显著(P>0.05),与网胃、十二指肠、瓣胃、皱胃、盲肠、结肠、直肠和胰腺差异显著(P<0.05);回肠相对表达量与瘤胃和网胃差异不显著(P>0.05),与十二指肠、瓣胃、皱胃、盲肠、结肠、直肠和胰腺差异显著(P<0.05);十二指肠、瓣胃、皱胃、盲肠、结肠、直肠和胰腺差异不显著(P>0.05)。　　3、鲁西牛消化道各段中pepT1基因的表达差异性　　消化道各段组织中pepT1基因的mRNA的表达同样也表现了明显的差异性。其相对表达量(2-△△CT值)由高到低依次为空肠(29.84)、回肠(24.24)、瘤胃(22.07)、网胃(16.01)、十二指肠(11.36)、瓣胃(4.56)、皱胃(3.13)、盲肠(1.20)、胰腺(1.00)、结肠(1.00)、直肠(0.99),消化道各段表达差异显著(P<0.05)。其中空肠相对表达量与回肠和瘤胃差异不显著(P>0.05),与网胃、十二指肠、瓣胃、皱胃、盲肠、结肠、直肠和胰腺差异显著(P<0.05);回肠相对表达量与瘤胃和网胃差异不显著(P>0.05),与十二指肠、瓣胃、皱胃、盲肠、结肠、直肠和胰腺差异显著(P<0.05);十二指肠、瓣胃、皱胃、盲肠、结肠、直肠和胰腺差异不显著(P>0.05)。　　4、T1R1、T1R3、pepT1基因在鲁西牛消化道同一段中的表达分析　　我们将T1R1、T1R3、pepT1在消化道同一段中的表达进行了分析,发现三个基因在消化道11个不同部位的表达表现出相同的表达规律,一个基因表的量高的部位,其他两个基因表达量也高;一个基因表达量低的部位,另外两个基因表达量也低,即三个基因具有相同的表达规律。三个基因在同一组织的表达量差异不显著,但在不同组织之间表达量差异明显。其具体表达量为:在空肠中T1R1的量是29.34,T1R3的表达量是29.34,pepT1的表达量是29.84;在回肠中T1R1的量是23.25,T1R3的表达量是23.25,pepT1的表达量是24.24;在瘤胃中T1R1的量是21.50,T1R3的表达量是21.50,pepT1的表达量是22.07;在网胃中T1R1的量是15.95,T1R3的表达量是16.50,pepT1的表达量是16.01;在十二指肠中T1R1的量是11.01,T1R3的表达量是10.98,pepT1的表达量是11.36;在瓣胃中T1R1的量是4.53,T1R3的表达量是4.51,pepT1的表达量是4.56;在皱胃中T1R1的量是3.00,T1R3的表达量是3.03,pepT1的表达量是3.13;在盲肠中T1R1的量是1.20,T1R3的表达量是1.20,pepT1的表达量是1.20;在胰腺中T1R1的量是1.00,T1R3的表达量是1.00,pepT1的表达量是1.00;在结肠中T1R1的量是0.98, T1R3的表达量是1.00,pepT1的表达量是1.00;在直肠中T1R1的量是0.96,T1R3的表达量是0.96,pepT1的表达量是0.99。这说明三个基因在氨基酸的吸收调控中具有明显的　　从以上的结果我们可知,T1R1、T1R3、pepT1这3个基因在鲁西牛的消化道各段中均表达,并且这3个基因在消化道各段中的表达差异性是一致的。其中, T1R1、T1R3基因在空肠、回肠和瘤胃中的表达量最高,由此,我们可以初步推测,反刍动物氨基酸吸收调控的主要部位是空肠、回肠和瘤胃,而氨基酸吸收所依赖的pepT1基因在这个3个部位的表达量同样也很高,说明了这3个基因在氨基酸吸收调控中存在协同作用,初步推测反刍动物吸收了氨基酸后,与氨基酸受体T1R1/T1R3结合后调控着pepT1对所吸收的氨基酸的转运。

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引言

1 文献综述

1.1 氨基酸受体研究简介

1.2小肽转运蛋白载体1简介

1.3 实时荧光定量PCR简介

2 实验技术路线、材料和方法

2.1 实验技术路线

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验统计分析

3 实验结果

3.1提取的总RNA

3.2 所研究基因T1R1、T1R3、pepT1 和管家基因β-actin最佳退火温度

3.3 T1R1、T1R3、pepT1和β-actin特异性目的片段的回收

3.4菌液PCR鉴定阳性重组子

3.5提取质粒测序

3.6 目的基因和管家基因扩增效率的验证

3.7 鲁西牛消化道各段中T1R1、T1R3及pepT1 mRNA的相对表达结果

3.8 T1R1、T1R3、pepT1基因与氨基酸吸收调控的相关性分析

4 讨论

4.1 相关实验方法的改进探讨

4.2 实验结果的分析与讨论

5 结论与创新点

5.1 结论

5.2 创新点

参考文献

作者简介

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