引起森林蜘蛛和蝉自然流行病的三种虫生真菌的种群异质性

摘要

蝉是我国北亚热带落叶阔叶林和中亚热带常绿阔叶林昆虫区系的重要成分，而蜘蛛则是全世界森林昆虫的重要捕食性天敌。它们的种群常受到虫生真菌自然流行病的调节。了解这些真菌的种群异质性对于理解真菌流行病的发生和发展及其在昆虫种群自然调节中的作用具有重要意义。
　　 本研究调查了皖东琅琊山森林公园、皇甫山自然保护区以及皖南牯牛降自然保护区蝉和蜘蛛的真菌自然流行病，发现紫色野村菌（Nomuraea atypicola）是森林蜘蛛自然流行病的主要病原，柱孢绿僵菌（Metarhizium cylindrosporae）是蝉成虫流行病的主要病原，而蝉棒束孢（Isaria cicadae）是蝉若虫流行病的主要病原。应用ISSR分子标记研究了这三种虫生真菌遗传多样性，探讨了自然流行病的发生与病原种群异质性之间的关系，发现在森林中这三种病原真菌种群间和种群内具有不同遗传多样性和异质性。
　　 1．紫色野村菌的种群与流行病的发生筛出的9个ISSR引物共扩增出117条带，多态性比率高达94％。ISSR扩增结果显示。22株紫色野村菌之间的遗传分化较大，Jaccard遗传相似系数为0.48～0.88，平均为0.71。UPGMA方法构建的系统树表明，在遗传相似系数0.60处，22株紫色野村菌按照两个自然保护区明显分为2大类群。第一大类是分离自琅琊山不同蜘蛛的10株菌株，其种群内平均遗传相似系数为0.74。第二大类是都采自牯牛降不同蜘蛛的12株菌株，其种群内平均遗传相似系数为0.76。种群内的遗传相似性虽高于种群问的遗传相似性，但未见两株菌株的ISSR指纹图谱相同或高度相似。这表明，不管是在琅琊山还是在牯牛降，紫色野村菌的两个种群均无优势的流行菌株。两地的蜘蛛流行病都是由高度异质的紫色野村菌种群造成的。紫色野村菌的菌株的遗传相似性和地理来源相关而和寄主无关。
　　 2．柱孢绿僵菌的种群与流行病的发生用10条引物对琅琊山和皇甫山的35个柱孢绿僵菌菌株扩增，共得到103条带，多态性百分率为75％。总的来看，35株柱孢绿僵菌中采自同一地区的种群各菌株之间的遗传分化不大，而不同地区的菌株间的遗传分化却很大。各菌株的遗传相似系数范围在0.29～1.00之间。柱孢绿僵菌完全按照地区不同分成了两大类。第一大类类包含17个菌株，全部为采自琅琊山，平均遗传相似系数为0.98，其中出现了ISSR指纹图谱完全一样的菌株，第二大类包含的18个菌株全部采自皇甫山，平均遗传相似系数为0.97，出现了ISSR指纹图谱完全一样的菌株。两大类种群之间的遗传相似系数却比较小，平均仅为0.31。从以上分析可以看出，两个地区所采集柱孢绿僵菌种群内的菌株之间高度相似，种群异质性小，但是优势性明显，出现了一些优势菌株。两地的蝉成虫的流行病都是由异质性低，优势性明显的柱孢绿僵菌种群造成的。
　　 3．蝉棒束孢的种群与流行病的发生用9条引物对52个蝉棒束孢菌株扩增，共得到97条带，多态性百分率为69％。从按采集时间划分的四个亚种群来看，07年7月份所采集的菌株平均Nei's指数（H）最高，为0.1868，Shannon指数（I）为0.2848，可见夏季采集的菌株的遗传多样性比春秋冬季的遗传多样性要大。各遗传距离在0.0503-0.1864之间，遗传距离最小的是08年5月和08年7月，遗传距离最大的月份出现在07年7月和08年5月。该种群总基因多样度（Ht）为0.1740，种群内基因多样度（Hs）为0.0926。蝉棒束孢的遗传分化系数（Gst）为0.4679，基因流Nm为0.5685，相对较弱。说明引起流行病的遗传分化小的优势菌种可能由于遗传漂变而导致遗传多样性的减小，将不利于种群对环境的适应。异质性小优势性强的种群可能只引起短暂的流行病，不利于病原物种群的自我维持，不利于自然流行病的持续发生。
　　 4．转录间隔区（ITS）序列分析本实验还利用ITS序列分析的方法对采自皖东琅琊山和皇甫山的柱孢绿僵菌以及部分采自牯牛降的蝉棒束孢进行了研究，结果发现：供试菌株的ITS区域内没有发生较大长度的突变，蝉棒束孢的此序列完全一样，而不同地区的柱孢绿僵菌的ITS区域也只有有2个碱基的差异。这说明ITS序列分析方法在区分种下的遗传差异时信息量略嫌不足。

目录

文摘

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声明

文献综述

1引言

2引起蜘蛛流行病的紫色野村菌的种群异质性的研究

2.1实验材料

2.1.1供试菌株及其来源

2.1.2培养基

2.1.3主要仪器及试剂

2.1.4主要试剂与配方

2.2方法与步骤

2.2.1菌种的采集和分离

2.2.2菌丝体的制备

2.2.3 DNA的提取与纯化

2.2.4.DNA浓度和质量的检测

2.2.5 ISSR扩增反应及检测

2.3 ISSR电泳图谱统计与分析

2.3.1数据统计方法

2.3.2统计计算

2.4结果与分析

2.4.1菌种采集及分离结果

2.4.2基因组DNA琼脂糖检测

2.4.3 ISSR扩增引物筛选结果

2.4.4多态性分析

2.4.5聚类分析

3引起蝉流行病的柱孢绿僵菌的种群异质性的研究

3.1实验材料

3.2方法与步骤

3.3 ISSR电泳图谱统计与分析

3.4结果与分析

3.4.1菌种采集和分离结果

3.4.2基因组DNA琼脂糖检测

3.4.3 ISSR扩增引物筛选结果

3.4.4多态性分析

3.4.5聚类分析

4引起蝉若虫流行病的蝉棒束孢种群异质性的研究

4.1实验材料

4.2方法与步骤

4.3 ISSR电泳图谱统计与分析

4.4结果与分析

4.4.1菌株采集和分离结果

4.4.2基因组DNA琼脂糖检测

4.4.3 ISSR扩增引物筛选结果

4.4.4多态性分析

4.4.5不同季节蝉棒束孢菌株的遗传结构分析

4.4.6蝉棒束孢不同居群的遗传一致度和遗传距离

4.4.7群体间遗传关系的UPGMA聚类分析

4.4.8所有蝉棒束孢菌株的聚类分析

5利用ITS研究虫生真菌的遗传多样性

5.1实验材料

5.2方法与步骤

5.2.1菌丝体的制备

5.2.2 DNA的提取与纯化

5.2.3 DNA浓度和质量的检测

5.2.4 ITS片段的扩增

5.3结果与分析

5.3.1 PCR扩增产物的电泳检测

5.3.2 ITS序列的分析

6讨论

6.1紫色野村菌的种群异质性与其引起的流行病

6.2柱孢绿僵菌的种群异质性与其引起的流行病

6.3蝉棒束孢的种群遗传结构与其引起的流行病

6.4病原种群异质性和流行病发生

7结论

参考文献

致谢

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