烟草吡哆胺-丙酮酸转氨酶的部分纯化与表征

摘要

维生素B6(VB6)是一类吡啶化合物的总称，游离型为吡哆醇(Pyridoxine，PN)、吡哆胺(Pyridoxamine，PM)和吡哆醛(Pyridoxal，PL)，三者相应磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate，PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate，PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate，PLP)。其中PLP是VB6的主要辅酶形式，参与氨基酸的各种代谢反应与多种物质的代谢。烟草作为一种模式植物，也成为VB6研究的实验材料，研究发现PLP、PL和PN是烟草VB6的主要存在型，烟草VB6还与植物抗逆性有关。吡哆胺-丙酮酸转氨酶(EC2.6.1.30，Pyridoxamine-pyruvateaminotransferase，简称PPAT)以PM和丙酮酸为底物生成PL和L-丙氨酸，PPAT涉及到VB6降解途径，对研究VB6代谢具有重要意义。虽然细菌体内PPAT已有广泛的研究，但是植物体内PPAT的研究则尚未见报道。烟草是重要的经济作物之一，本文以烟草为研究对象，提取并分析PPAT酶学性质，为深入研究PPAT的催化机制建立了基础。
　　 本文通过冷冻干燥、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换柱层析、SephadexG-100凝胶过滤柱层析，SP葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱层析等分离纯化技术，对烟草PPAT进行分离纯化，并对其基本酶学性质进行分析。研究结果表明：该酶被纯化了92.34倍；酶的最适pH为9.0，且酶液在pH7.0～9.0范围内稳定；该酶最适温度为70℃，且热稳定性较好，80℃保温3h仍有51.55％的酶活力；酶活反应中添加PLP、PMP既不能促进也不能抑制其反应的进行，苯肼、硼氢化钠、羟胺等几种典型的PLP-依赖型酶抑制剂也不能抑制其活性；在最适反应条件下，测得反应底物吡哆胺和丙酮酸的Km值分别为6.337mmol/L，0.867mmol/L。为进一步研究烟草体内VB6代谢机制奠定了基础。