致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛双重PCR方法建立与应用

摘要

致病性大肠杆菌(pathogenicEscherichiacoli)和沙门氏菌(Salmonellaspp.)是引起食源性疾病的两种重要的致病菌。流行病学报告表明，大肠杆菌和沙门氏菌的致病性与其自身携带的毒力岛基因具有相关性。毒力岛的发现和研究，对深入了解细菌性疾病的发生发展过程以及对疾病的预防控制都有着深远影响。
　　 本课题根据致病性大肠杆菌和沙门氏菌毒力岛标志性基因设计引物，利用PCR技术分别对这两种细菌的毒力岛基因进行特异性扩增，通过扩增条件的优化及引物组合配对，进而建立致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛基因的双重PCR检测方法，试图达到对这两种细菌的快速同步检测。运用该方法对畜禽大肠杆菌和沙门氏菌进行调查，旨在为人畜共患大肠杆菌病和沙门氏菌病的预防和控制提供理论依据。
　　 具体研究内容和结果如下：
　　 1、大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛标志性基因的PCR检测
　　 本研究以致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛为切入点，根据GenBank中已发表的致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛标志性基因序列，分别设计合成了致病性大肠杆菌毒力岛irp1、irp2和fyuA，沙门氏菌毒力岛mgtC、sseL和sopB等6对特异性引物，提取大肠杆菌(CVCC1565)菌株和沙门氏菌(ATCC9150)菌株的DNA作为模板，对致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛基因进行PCR检测，并对扩增反应条件进行优化。结果表明，致病性大肠杆菌毒力岛标志性基因引物irp1、irp2和fyuA能扩增出大肠杆菌(CVCC1565)毒力岛片段，大小分别是799bp，414bp和948bp；沙门氏菌毒力岛标志性基因引物mgtC、sseL和sopB能扩增出沙门氏菌(ATCC9150)毒力岛片段，大小分别是500bp，269bp和1000bp。实验选取了对扩增效率影响较大的引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度这两个重要参数进行了优化研究，结果显示所建立的PCR优化体系为25μL，包括0.5μL引物F(100um)，0.5μL引物R(100um)，0.5μLTaqDNA聚合酶(5U)，2.5μL10×PCR缓冲液(Mg2+)，2.5μLDNA模板，1.0μLdNTP(10mM)，加灭菌超纯水至25μL。
　　 2、致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛基因双重PCR检测方法的建立
　　 根据PCR优化体系，对致病性大肠杆菌毒力岛标志性基因irp1、irp2和fyuA引物和沙门氏菌毒力岛标志性基因，mgtC、sseL和sopB引物进行特异性实验，结果表明，引物irp1、irp2和fyuA仅能扩增出大肠杆菌(CVCC1565)的特异性片段，引物，mgtC、sseL和sopB仅能扩增出鼠伤寒沙门氏菌(ATCC9150)的特异性片段。为进一步寻找双重PCR最优引物组合，设计2组引物组合，引物组合1为致病性大肠杆菌fyuA基因&沙门氏菌mgtC基因，引物组合2为致病性大肠杆菌fyuA基因&沙门氏菌sseL基因，根据最终扩增效果选择引物组合1：致病性大肠杆菌fyuA基因&沙门氏菌mgtC基因建立致病性大肠杆菌、沙门氏菌双重PCR检测方法。敏感性试验结果表明致病性大肠杆菌和沙门氏菌的最低检测限分别为2.2×101cfu·mL-1和2.0×101cfu·mL-1。以上数据说明该研究建立的致病性大肠杆菌、沙门氏菌的双重PCR检测方法敏感性高、特异性强。
　　 3、致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛双重PCR检测方法的应用
　　 本研究选取合肥附近的屠宰场养殖场共采集粪便样品24份，通过对采集的畜禽粪便样品进行了分离，培养及生化鉴定，筛选出符合大肠杆菌和沙门氏菌特征的菌株各有24株。运用建立的致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛基因的双重PCR检测方法对筛选的畜禽大肠杆菌沙门氏菌进行检测。结果显示：在24株畜禽大肠杆菌分离株中，有20株检测出具有大肠杆菌毒力岛fyuA基因，检出率为83.3％；在24株畜禽沙门氏菌分离株中，有23株检测出具有沙门氏菌毒力岛mgtC基因，检出率为95.8％。以上数据说明该研究建立的致病性大肠杆菌、沙门氏菌的双重PCR检测适用于畜禽大肠杆菌和沙门氏菌的快速诊断与分子流行病学调查。
　　 上述研究表明，建立的致病性大肠杆菌、沙门氏菌毒力岛双重PCR检测方法具有敏感性强、特异性高的特点，适用于畜禽大肠杆菌和沙门氏菌的快速检测，同时能对人畜共患大肠杆菌病和沙门氏菌病的预防和控制提供了理论指导。